楊紅,李曉賓,李婷,賈三三,王海龍,宋國(guó)華,郭睿*

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 太原　030001;

2. 山西醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室, 太原　030001;

3. 山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，太原　030001.)

?

絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶SRPK2在小鼠睪丸組織中的表達(dá)及意義

楊紅1, 李曉賓1, 李婷1, 賈三三1, 王海龍2, 宋國(guó)華3,郭睿1*

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 太原030001;

2. 山西醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室, 太原030001;

3. 山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，太原030001.)

【摘要】目的通過研究絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2，SRPK2) 基因mRNA及其編碼蛋白產(chǎn)物在小鼠睪丸組織中的表達(dá)特征，探討該基因在精子發(fā)生過程中的作用及意義。 方法分別采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡雜交(Western blotting)分析該基因mRNA及蛋白產(chǎn)物在小鼠多種組織中的表達(dá)；利用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR)分析SRPK2 mRNA在不同發(fā)育階段小鼠睪丸組織中的差異表達(dá)；應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和間接免疫熒光技術(shù)觀察SRPK2蛋白在小鼠曲精小管中的細(xì)胞定位和生精細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位。 結(jié)果半定量RT-PCR和Western blotting分析顯示SRPK2 mRNA和蛋白在小鼠睪丸組織中均大量表達(dá)；實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)SRPK2 mRNA在5周及8周齡雄性小鼠睪丸組織中顯著表達(dá)，具有明顯的階段特異性表達(dá)特征。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明SRPK2蛋白陽性著色主要位于曲精小管中的長(zhǎng)形精子細(xì)胞核；間接免疫熒光分析顯示SRPK2蛋白定位于長(zhǎng)形精子細(xì)胞核表面。 結(jié)論SRPK2基因在小鼠睪丸組織中大量表達(dá)，并且具有顯著的階段特異性表達(dá)特征和明確的細(xì)胞核定位，極有可能在小鼠精子發(fā)生的變態(tài)成形期參與mRNA前體分子的剪接過程，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

【關(guān)鍵詞】SRPK2；精子發(fā)生；小鼠

Expression and significance of SR-protein-specific

哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜而特異的細(xì)胞分化過程，分為有絲分裂期、減數(shù)分裂期和變態(tài)成形期。其中，精子細(xì)胞的變態(tài)成形是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是體內(nèi)其他任何細(xì)胞不具備的獨(dú)特現(xiàn)象。在變態(tài)成形階段，單倍體圓形精子細(xì)胞需要經(jīng)過復(fù)雜的變態(tài)分化，才能發(fā)育為具有頭、頸、尾結(jié)構(gòu)的特異精子。主要的形態(tài)學(xué)改變包括：核染色體緊密包裝，細(xì)胞核濃縮變長(zhǎng)，高爾基體衍變成為頂體，以微管和肌動(dòng)蛋白為主的精尾形成。精子細(xì)胞這一特殊的分化方式必定受到多種因素的精確調(diào)控，探討其內(nèi)在過程及參與分子的功能將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)精子發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制。

精子發(fā)生相關(guān)蛋白3(spermatogenesis-associated protein 3，SPATA3)基因是近年發(fā)現(xiàn)的睪丸組織特異高表達(dá)基因，國(guó)外學(xué)者應(yīng)用基因芯片技術(shù)證實(shí)該基因在人類非梗阻性無精子癥患者睪丸組織中的表達(dá)顯著降低，可作為該類男性不育癥的潛在分子標(biāo)志用于臨床診斷[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)小鼠spata3基因在5周和8周齡小鼠睪丸組織中高度表達(dá)，可能參與精子發(fā)生后期精子細(xì)胞的變態(tài)成形過程[2]。以小鼠spata3基因cDNA全長(zhǎng)構(gòu)建誘餌質(zhì)粒，從蛋白水平出發(fā)采用酵母雙雜交技術(shù)篩選小鼠睪丸cDNA文庫，獲得了與spata3存在相互作用的絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2，SRPK2)。SRPK2蛋白屬于SRPK激酶家族，能夠磷酸化富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子蛋白，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)mRNA前體的剪接加工[3]。有實(shí)驗(yàn)表明SRPK2主要在腦組織和睪丸組織大量表達(dá)[4]，但目前絕大多數(shù)關(guān)于SRPK2的研究集中在腦組織，在睪丸組織中的表達(dá)研究鮮有報(bào)道。為了深入探討SRPK2在精子發(fā)生過程中的作用，分別從mRNA和蛋白水平分析SRPK2在小鼠睪丸組織中的表達(dá)特性，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠，1周齡10只，體重2～4 g；2周齡6只，體重4～8 g；3周齡2只，體重8～12 g；5周齡1只，體重17～20 g；8周齡2只，體重20～25 g，均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(晉)2009-0001】，組織取材于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室完成【SYXK(晉)2003-0003】，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2引物序列

根據(jù)SRPK2編碼基因(基因登錄號(hào)：NM_009274.2)序列設(shè)計(jì)引物，上游引物為5′-GCTACAGCACACCTGCAGACA-3′，下游引物為5′-CAGAATGCGGTTCGAACAAATAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為87 bp。實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參照，上游引物為5′-CTATTGGCAACGAGCGGT-3′，下游引物為5′-GGTCTTTACGGATGTCAACG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為132 bp。上述引物均由TaKaRa公司合成。

1.3主要試劑

RNA提取Trizol試劑和抗淬滅封片劑由Invitrogen公司提供，HiFi-MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液均為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品，SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，BSA、封閉用正常山羊血清為Solarbio公司產(chǎn)品，小鼠抗β-actin單克隆抗體、SRPK2兔抗多克隆抗體購(gòu)自Biorbyt公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG由北京中杉金橋有限公司提供，Cy3標(biāo)記驢抗兔熒光二抗由Jackson公司提供，通用型免疫組化試劑盒為武漢博士德生物公司產(chǎn)品。

1.4半定量RT-PCR分析SRPK2 mRNA的組織特異性表達(dá)

頸椎脫臼處死8周齡雄性小鼠，迅速取出其心、肝、腦、腎、脾、肺和睪丸組織置于液氮中，加入適量Trizol試劑提取小鼠各組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，取2 μg進(jìn)行RT-PCR分析，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)。同時(shí)以管家基因β-actin作為內(nèi)參照，反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)2.0 %瓊脂糖凝膠電泳分析檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5Western blotting分析SRPK2蛋白在各組織中的表達(dá)水平

頸椎脫臼處死8周齡雄性小鼠，提取心、肝、腦、腎、脾、肺和睪丸組織總蛋白，并采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。各取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，分別以小鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶1000)及兔抗SRPK2多克隆抗體(1∶100)為一抗4℃雜交過夜，次日以山羊抗小鼠HRP-IgG(1∶5000)、山羊抗兔HRP-IgG(1∶5000)為二抗，室溫雜交1 h，采用ECL發(fā)光法檢測(cè)，通過BIO-RAD凝聚成像儀分析結(jié)果。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SRPK2 mRNA的階段特異性表達(dá)

分別提取1、2、3、5和8周齡雄性小鼠睪丸組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)采取兩步法，每個(gè)樣品均設(shè)立三個(gè)平行管，具體擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 15 s，57℃ 1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每次反應(yīng)均設(shè)置熔解曲線分析，以證實(shí)無非特異性擴(kuò)增，同時(shí)以管家基因β-actin作為內(nèi)參照。SRPK2基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用ΔΔCT法，以3周齡睪丸組織中該基因的表達(dá)量為參照，取值為1。

1.7免疫組織化學(xué)染色顯示SRPK2蛋白在曲精小管中的細(xì)胞定位

取8周齡雄性小鼠睪丸組織，經(jīng)4 %多聚甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚5 μm)，裱片于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，溫箱烘干。免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用ABC法，滴加兔抗SRPK2多克隆抗體(1∶100)4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，次日滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶200)室溫孵育1 h，滴加ABC復(fù)合液后37℃濕盒內(nèi)溫育30 min，常規(guī)DAB顯色，蘇木素復(fù)染(同時(shí)選取數(shù)張不進(jìn)行復(fù)染)、脫水、透明、封片，鏡下觀察結(jié)果，結(jié)果判定以出現(xiàn)棕黃色著色為陽性染色。實(shí)驗(yàn)同時(shí)以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.8間接免疫熒光染色分析SRPK2蛋白在生精細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

取8周齡雄性小鼠睪丸組織置于預(yù)冷的PBS中，快速分離曲精小管，并使用膠原酶消化成為散在的單細(xì)胞，取50 μL涂片，室溫晾干。封閉后滴加兔抗SRPK2多克隆抗體(1∶100)，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，次日滴加Cy3標(biāo)記的驢抗兔二抗(1∶400)37℃孵育2 h，充分洗滌后滴加20 μL含DAPI的抗淬滅封片劑，避光，立即在共聚焦激光顯微鏡下觀察并攝片。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，同時(shí)以1% BSA/PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

2結(jié)果

2.1SRPK2 mRNA在小鼠多種組織中的半定量RT-PCR分析

以雄性小鼠7種組織(心、肝、腦、腎、脾、肺、睪丸)總RNA為模板進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果見圖1?？梢奡RPK2基因mRNA在小鼠睪丸組織中的擴(kuò)增條帶尤為明顯，經(jīng)過灰度掃描，以β-actin基因的表達(dá)量作為參照，計(jì)算該基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量(見圖2)，結(jié)果表明SRPK2基因mRNA在小鼠睪丸組織中的表達(dá)量最高，其次在腎臟和腦組織中也有一定強(qiáng)度表達(dá)，而其他組織的表達(dá)則相對(duì)較弱甚至缺如。

注:M. Marker； 1.心； 2.肝； 3.脾； 4.腦； 5.腎； 6.肺； 7.睪丸。　　圖1　SRPK2基因在小鼠不同組織中RT-PCR結(jié)果Note.M. Marker; 1. Hheart; 2. Lliver; 3. Sspleen; 4. Bbrain; 5. Kkidney; 6. Llung; 7. Ttestis.　　Fig.1　The RT-PCR analysis of SRPK2 in several organ-tissues of BALB/c mice

注:1.心； 2.肝； 3.脾； 4.腦； 5.腎； 6.肺； 7.睪丸?！　D2　SRPK2 mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)Note.1. Heart; 2. Liver; 3. Spleen; 4. Brain; 5. Kidney; 6. Lung; 7. Testis.　　Fig.2　Relative expression of SRPK2 mRNA in different tissues of the mice

2.2Western blotting分析SRPK2蛋白在小鼠不同組織中的表達(dá)

Western blotting結(jié)果(圖3)顯示目的條帶約55 ×103，與預(yù)期大小基本一致。睪丸組織對(duì)應(yīng)的陽性條帶最為顯著，腦組織和腎臟中SRPK2蛋白陽性條帶也比較明顯，而其他組織未檢測(cè)到該基因產(chǎn)物的表達(dá)。以β-actin蛋白表達(dá)量作為參照，利用凝膠分析軟件進(jìn)行掃描，計(jì)算SRPK2/β-actin灰度比值，用來表示SRPK2蛋白在各組織中的相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算結(jié)果表明睪丸組織中SRPK2蛋白的表達(dá)量為2.613，腎臟和腦組織中該蛋白的表達(dá)量分別為1.235和1.038。

2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SRPK2 mRNA在小鼠不同發(fā)育階段睪丸組織中的表達(dá)

注:　1.心； 2.肝； 3.脾； 4.腦； 5.腎； 6.肺； 7.睪丸。　　圖3　Western blotting 檢測(cè)SRPK2蛋白在小鼠不同組織中的表達(dá)Note.1. Heart; 2. Liver; 3. Spleen; 4. Brain; 5. Kidney; 6. Lung; 7. Testis.　　Fig.3　Expression of SRPK2 protein in different tissues by Western blotting

圖4　實(shí)時(shí)定量PCR分析SRPK2 mRNA的階段特異性表達(dá)　　Fig.4　Stage-specific expression of SRPK2 mRNA detected by real-time quantitative PCR

通過實(shí)時(shí)定量PCR分析SRPK2 mRNA在不同發(fā)育階段小鼠睪丸組織中的相對(duì)表達(dá)量(見圖4)，結(jié)果顯示SRPK2 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)呈規(guī)律性增強(qiáng)。設(shè)定該基因在3周齡小鼠睪丸組織中的表達(dá)量為1，可見在1周和2周齡小鼠睪丸中的表達(dá)很弱，后逐漸增強(qiáng)，5周齡和8周齡時(shí)SRPK2的表達(dá)水平分別約為3周齡的2.6 和2.7倍。2.4免疫組化染色檢測(cè)SRPK2蛋白在曲精小管中的細(xì)胞定位圖5為免疫組化染色結(jié)果，可以看到SRPK2蛋白陽性信號(hào)呈棕黃色顆粒，主要分布在曲精小管內(nèi)長(zhǎng)形精子細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)域，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞以及圓形精子細(xì)胞中未見明顯的陽性信號(hào)存在。

2.5間接免疫熒光染色檢測(cè)SRPK2蛋白在生精細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

利用間接免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)SRPK2蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果見圖6所示。在多種類型細(xì)胞混雜存在的視野中，可以看到紅色熒光標(biāo)記的SRPK2蛋白只在長(zhǎng)形精子細(xì)胞核附近的位置表現(xiàn)出強(qiáng)烈的陽性信號(hào)，其他細(xì)胞未見明顯的陽性著色(B、D)。從F能夠明顯看到SRPK2蛋白紅色熒光信號(hào)呈“彎月狀”緊密附著在長(zhǎng)形精子細(xì)胞核凸起側(cè)，并靠近精子頭部。

注：A. SRPK2蛋白的細(xì)胞定位,蘇木素復(fù)染；B. SRPK2蛋白的細(xì)胞定位,未復(fù)染；C. 陰性對(duì)照?！　D5　SRPK2蛋白在小鼠睪丸曲精小管中的免疫組化染色Note. A. Ccellular localization of SRPK2 protein, hematoxylin staining; B. Ccellular localization of SRPK2 protein, No restained with hematoxylin; C. Negative control.　　Fig.5　Immunohistochemical staining of SRPK2 protein in seminiferous tubules of the mouse testis

注：A, C, E. DAPI染色；B, D, F. 組合圖?！　D6　間接免疫熒光染色顯示SRPK2蛋白在生精細(xì)胞中的定位Note.：A, C, E. DAPI staining; B, D, F. The merge of DAPI and Cy3 staining.　　Fig.6　Localization of SRPK2 protein in spermatic cells by indirect immunofluorescence staining

3討論

哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生受到一系列因素的協(xié)同調(diào)節(jié)，只有在特定基因精密而嚴(yán)格的調(diào)控下，才能產(chǎn)生具有頭、頸、尾結(jié)構(gòu)的特異精子，輸出到附睪獲得授精能力。如果這一過程相關(guān)的關(guān)鍵基因缺陷、突變或表達(dá)異常，都有可能使精子細(xì)胞不能完成正常的分化過程，從而導(dǎo)致精子生成障礙，引起雄性動(dòng)物不育。近年來，許多研究人員借助基因敲除小鼠模型已經(jīng)證實(shí)，與精子細(xì)胞變態(tài)成形相關(guān)的重要基因缺失將直接導(dǎo)致精子發(fā)生停滯在變態(tài)成形期，致使成熟精子數(shù)目減少。這類基因主要包括 selenium、Atg7、Iqcg、RNASE9、PA-PLA1、CHD5、Taf7l、Trf2、KIF3A等[5～12]?？v觀這些基因在小鼠睪丸組織中的表達(dá)特征，可以發(fā)現(xiàn)它們都具有嚴(yán)格的階段特異性表達(dá)，大多在減數(shù)分裂完成后的圓形精子細(xì)胞階段含量豐富。這也間接說明這類基因在圓形精子細(xì)胞分化成為長(zhǎng)形精子細(xì)胞，以及成熟精子的過程中發(fā)揮了積極作用。因此，發(fā)現(xiàn)和鑒定類似基因?qū)ι钊胙芯烤蛹?xì)胞變態(tài)成形的分子機(jī)制及由于精子發(fā)生異常引起的男性不育癥具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。

SPATA3在精子發(fā)生過程中具有與上述基因相似的階段特異表達(dá)特征，推測(cè)該基因可能參與了精子細(xì)胞的變態(tài)成形。以SPATA3為誘餌，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選獲得了SRPK2。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，SRPK2激酶能夠催化靶蛋白特異部位的絲氨酸發(fā)生磷酸化，從而調(diào)節(jié)富含絲氨酸/精氨酸蛋白(常被稱為SR蛋白)的活性。SR蛋白屬于RNA結(jié)合蛋白，能夠作為剪接因子參與形成剪接體，協(xié)助完成細(xì)胞核內(nèi)mRNA前體的剪接加工，轉(zhuǎn)變成為成熟mRNA，進(jìn)入胞漿發(fā)揮翻譯模板的作用[3]。因此，活化的SR蛋白能夠促進(jìn)mRNA成熟，繼而加速新蛋白的合成。但SR蛋白本身并無活性，需要SRPK磷酸化其特異位點(diǎn)的絲氨酸才能將之激活。

SRPK家族包括SRPK1和SRPK2，Northern blotting結(jié)果顯示二者在睪丸組織均有大量表達(dá)[4, 13, 14]，并且研究者通過原位雜交實(shí)驗(yàn)表明SRPK1蛋白存在于小鼠睪丸曲精小管多種生精細(xì)胞內(nèi)，但關(guān)于SRPK2蛋白的細(xì)胞定位至今未見有研究論文發(fā)表。實(shí)驗(yàn)利用半定量RT-PCR證實(shí)SRPK2 mRNA在睪丸組織大量表達(dá)，Western blotting結(jié)果也顯示SRPK2蛋白在睪丸組織含量豐富，分別從mRNA和蛋白水平驗(yàn)證了其他研究者的結(jié)論。另外，還利用不同周齡小鼠睪丸組織為實(shí)驗(yàn)材料，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了SRPK2 mRNA的階段特異性表達(dá)。結(jié)果表明SRPK2 mRNA在5周齡和8周齡小鼠睪丸中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他階段，提示該基因主要在精子發(fā)生的中、后期大量表達(dá)。5周齡小鼠睪丸曲精小管中已出現(xiàn)較多數(shù)量的圓形精子細(xì)胞；8周齡中有40%的生精細(xì)胞是長(zhǎng)形精子細(xì)胞[15]。為了確定SRPK2蛋白在各類生精細(xì)胞中的定位，進(jìn)一步應(yīng)用免疫組化和免疫熒光染色觀察了該蛋白的表達(dá)情況。從最終的染色結(jié)果可以清楚地看到SRPK2蛋白定位在曲精小管內(nèi)部靠近管腔的長(zhǎng)形精子細(xì)胞核部位，并且在長(zhǎng)形精子核頭部凸起側(cè)有大量分布。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)所得，能夠判斷SRPK2 mRNA在小鼠精子發(fā)生過程中具有明顯的階段特異性表達(dá)特征， SRPK2蛋白在小鼠精子發(fā)生后期高度表達(dá)，主要存在于長(zhǎng)形精子細(xì)胞內(nèi)。

生物信息學(xué)分析是目前預(yù)測(cè)基因及蛋白功能非常有效的手段之一。經(jīng)過比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，小鼠SRPK2激酶的多肽鏈序列與SRPK1非常相似，其激酶區(qū)域的氨基酸種類與SRPK1有77%是完全相同的[14]。因此，這兩種激酶擁有相同的催化功能，都能使SR蛋白特異位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化。但SRPK2還具有SRPK1不存在的兩個(gè)獨(dú)特區(qū)域：氨基末端第21～43位氨基酸之間有脯氨酸富集區(qū)，肽鏈中部第287～405位氨基酸序列中有豐富的酸性氨基酸大量存在[4, 13]。由此決定了二者的部分理化性質(zhì)和催化底物的種類有所差別[16]，在細(xì)胞內(nèi)參與的生物學(xué)過程和存在的意義可能不盡相同。或許，這正是SRPK1與SRPK2同時(shí)在睪丸組織大量表達(dá)，但SRPK1存在于多種生精細(xì)胞，而SRPK2主要存在于長(zhǎng)形精子細(xì)胞的根本原因。在圓形精子細(xì)胞分化為成熟精子的過程中，需要大量mRNA與蛋白質(zhì)不斷合成，因此，這一階段mRNA前體的剪接加工活動(dòng)非?；钴S，而各種剪接因子正確組裝形成剪接體是必不可少的前提條件。課題組曾采用質(zhì)譜技術(shù)在變態(tài)成形期的精子細(xì)胞中檢測(cè)到60多種蛋白均參與了剪接體的組裝過程[17]，其中的SR蛋白必須首先被SRPK磷酸化激活才能參與形成剪接體，這可能就是SRPK2蛋白在長(zhǎng)形精子細(xì)胞大量存在的意義所在。但關(guān)于SRPK2在精子細(xì)胞變態(tài)成形過程中的具體作用及其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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·會(huì)訊·

中英第二屆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理國(guó)際論壇隆重召開

由中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理專業(yè)委員會(huì)和英國(guó)內(nèi)政部共同主辦的"中英第二屆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理國(guó)際論壇"于2015年3月17日至19日在北京裕龍國(guó)際酒店隆重召開。

3月18日上午，論壇舉行了開幕式。開幕式由論壇執(zhí)行主席、中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理專業(yè)委員會(huì)主任委員孫德明教授主持。科技部中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心賈敬敦主任、英國(guó)使館科技創(chuàng)新處凱倫處長(zhǎng)等領(lǐng)導(dǎo)出席論壇并發(fā)表了熱情洋溢的講話。中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)理事長(zhǎng)秦川教授委托出席會(huì)議的學(xué)會(huì)常務(wù)副秘書長(zhǎng)宋晶女士發(fā)表致辭。來自國(guó)內(nèi)外近200名專家學(xué)者參加了論壇。

本次論壇以“提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理管理規(guī)范和科技水平”為宗旨，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理管理法規(guī)與技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及進(jìn)展、善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、動(dòng)物保護(hù)和3R理念如何實(shí)踐、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的疼痛管理、麻醉鎮(zhèn)痛、福利倫理審查中的利弊分析、仁慈終點(diǎn)、替代技術(shù)、環(huán)境豐富、福利倫理認(rèn)證等相關(guān)的國(guó)際合作議題進(jìn)行廣泛而深入的探討，通過借鑒國(guó)際公認(rèn)的管理經(jīng)驗(yàn)和先進(jìn)的科技成果，以期推動(dòng)中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理管理和科技水平的快速提升。

論壇將于今日結(jié)束，更多詳情請(qǐng)關(guān)注后續(xù)報(bào)道及中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)網(wǎng)站發(fā)布的信息。

中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)秘書處供稿

研究報(bào)告

kinase SRPK2 in mouse testis

YANG Hong1, LI Xiao-bin1, LI Ting1, JIA San-san1, WANG Hai-long2,

SONG Guo-hua3, GUO Rui1

(1. Department of Biochemistry and Molecular Biology, 2. Department of Parasitology,

3. Laboratory Animal Center, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

【Abstract】ObjectiveTo analyze the expression characteristics of SRPK2 (serine / arginine-rich protein specific kinase 2 mRNA and its encoded protein products in mouse testis, and to reveal its molecular role during spermatogenesis. Methods Using semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting to analyze the expression of SRPK2 mRNA and its protein products in several mouse tissues. The stage-specific expression pattern of SRPK2 mRNA in mouse testis was examined by real-time quantitative PCR. Immunohistochemical staining was applied to identify the SRPK2 protein distribution in mouse testicular seminiferous tubules and indirect immunofluorescence staining was used to detect the subcellular localization of SRPK2 protein in spermatic cells. ResultsSemi-quantitative RT-PCR and Western blotting analysis revealed that SRPK2 was highly expressed in mice testis. Real-time quantitative PCR analysis showed that SRPK2 mRNA was expressed abundantly at the stage of 5-and 8-week old mouse testes, suggesting that SRPK2 gene has stage-specific expression patterns during mouse spermatogenesis. Immunohistochemical and indirect immunofluorescence staining demonstrated that SRPK2 protein was located around the surface of elongated sperm nucleus. ConclusionsSRPK2 is highly expressed in mouse testis and has significant stage-specific expression characteristics with distinct nuclear localization. These results indicate that SRPK2 may participate in precursor mRNA splicing during mouse spermiogenesis. The molecular mechanism of SRPK2 is yet to be further studied.

【Key words】SRPK2; Spermatogenesis; Mouse; Testis

[收稿日期]2014-09-17

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2015.02.013

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847(2015) 02-0171-07

[通訊作者]郭睿，女，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：發(fā)育生物學(xué)。E-mail： guoruipumc@aliyun.com

[作者簡(jiǎn)介]楊紅(1990年-)，碩士研究生在讀，主要研究方向：生殖細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控。E-mail： qianxiasx@126.com

[基金項(xiàng)目]山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(NO.2011-043)。