賀仕才，仇廣林，王澤興，車向明，David. S Wilkes，譙瞧，盧靖，樊林*

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科，西安　710061；2. 美國(guó)印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院，印第安納波利斯　46202)

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小鼠左肺原位移植模型的建立

賀仕才1，仇廣林1，王澤興1，車向明1，David. S Wilkes2，譙瞧1，盧靖1，樊林1*

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科，西安710061；2. 美國(guó)印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院，印第安納波利斯46202)

【摘要】目的通過(guò)顯微外科技術(shù)建立小鼠原位肺移植模型，為肺移植研究提供動(dòng)物模型。方法采用C57BL/6小鼠作為供、受體，行同基因小鼠原位左肺移植，使用Cuff套管法進(jìn)行氣管及血管吻合。術(shù)后7、14、21、28 d取移植肺及原肺，行HE染色，評(píng)價(jià)肺移植后效果。結(jié)果學(xué)習(xí)曲線后, 共30例小鼠移植，手術(shù)成功率89%，小鼠成活率100%。供體手術(shù)時(shí)間：(35.2±9.81 )min，受體手術(shù)時(shí)間：(24.6±7.42) min，冷缺血時(shí)間是：(46.6±8.92 )min，熱缺血時(shí)間是：(17.2±3.08 )min。同基因移植物大體及病理無(wú)明顯改變，病理顯示與原肺無(wú)差別。結(jié)論本技術(shù)能夠方便快捷建立小鼠肺移植模型，成功率高，可重復(fù)性強(qiáng)，符合原位肺移植臨床生理，是研究肺移植發(fā)病機(jī)制和治療的良好動(dòng)物模型。

【關(guān)鍵詞】原位肺移植；動(dòng)物模型；小鼠

肺移植是終末期肺病重要的治療手段，自1963年Hardy等[1]首次嘗試肺移植至今，肺移植已取得了巨大進(jìn)步，但其生存率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他移植，ISHLT[2]報(bào)道，肺移植后5 年生存率僅52%，10 年生存率僅29%。但目前肺移植后相關(guān)病理變化及其機(jī)制尚未完全闡明，因此建立動(dòng)物模型來(lái)研究其機(jī)制，尋找治療手段顯得尤為重要。既往都以大動(dòng)物及大鼠為動(dòng)物模型，但對(duì)于免疫排斥研究都有其局限性，故嘗試小鼠肺移植模型一直沒(méi)有間斷過(guò)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)顯微外科技術(shù)建立小鼠原位肺移植模型，為該領(lǐng)域的研究提供重要的模型參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠30只，雄性，體重25～30 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SCXK(陜)2012-003】。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作及取材均于西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行【SCXK(陜)2012-005】。所有研究均遵守西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品、手術(shù)器械及實(shí)驗(yàn)用設(shè)備

動(dòng)物用吸入麻醉藥物異氟醚，肝素，生理鹽水，林格氏液。立式手術(shù)顯微鏡(40倍)，小動(dòng)物麻醉呼吸機(jī)，20G、22G、24G套管針。常規(guī)切開(kāi)縫合器械，顯微鑷子，顯微血管鉗，顯微剪刀，5-0、9-0線，紗布，棉簽，1 mL和3 mL注射器，胸腔拉鉤等。

1.2方法

1.2.1套管制備

套管采用靜脈留置針制作，支氣管為20G套管，長(zhǎng)約1 mm，尾端長(zhǎng)約0.7 mm；肺動(dòng)脈為24G套管，長(zhǎng)約0.5 mm，尾端長(zhǎng)約0.7 mm；肺靜脈套管長(zhǎng)度根據(jù)供體小鼠體重決定：25～27 g的小鼠采用22G套管，長(zhǎng)約0.7 mm，尾端長(zhǎng)約0.7 mm，27～30 g的小鼠采用相同長(zhǎng)度的20G套管。套管尾不超過(guò)管周徑1/3，套管表面以砂紙打磨以利于吻合固定(圖1)。

1.2.2建立小鼠原位左肺移植模型

(1)供者手術(shù)

常規(guī)選取25～30 g雄性小鼠，經(jīng)5%異氟醚誘導(dǎo)后以20G導(dǎo)管氣管插管行全身麻醉。連接麻醉機(jī)以100%氧氣、心率125 次/分 和2 cm H2O 呼氣末正壓進(jìn)行通氣，異氟醚維持在1%～2%。麻醉成功后，取仰臥位，70%酒精消毒，取腹正中十字切口切開(kāi)腹壁，暴露下腔靜脈，注射0.1 mL(100 U/kg體重)肝素，牽出肝鐮狀韌帶，向兩側(cè)剪開(kāi)膈肌，以棉簽保護(hù)肺臟，經(jīng)胸廓兩側(cè)剪開(kāi)胸廓至第1肋，去除頸周皮膚和肌肉，將胸廓牽向頭側(cè)，去除胸腺及脂肪組織，充分暴露肺及心臟，剪開(kāi)剪斷下腔靜脈及左心耳，經(jīng)肺動(dòng)脈干根部以4℃肝素化林格氏液2 mL，10 cm H2O壓力，灌注肺臟，肺為白色后，固定氣管頭端，游離切斷氣管，連同心臟及雙肺切除后取出組織塊(圖2)。

(2)供肺準(zhǔn)備

將供鼠心、肺置于冰、水混合物上，首先用鑷子固定氣管和食管，將食管向尾端牽拉，去除食管，然后夾住降主動(dòng)脈和肺韌帶周圍的胸膜，將主動(dòng)脈牽向頭側(cè)，清晰暴露出左側(cè)肺門，固定肺動(dòng)脈，分離肺動(dòng)脈與支氣管，分至肺動(dòng)脈分叉處，離斷左肺動(dòng)脈，去除氣管隆突周圍的脂肪組織，暴露左主支氣管，并于氣管分叉處離斷左主支氣管，去除左心房周圍的脂肪組織，暴露肺靜脈，離斷左肺靜脈。肺動(dòng)脈使用24G Cuff 套管固定，支氣管使用20G Cuff 套管固定，肺靜脈根據(jù)小鼠體重選用相應(yīng)型號(hào)Cuff套管，均從套管尾端穿入，頭端穿出，外翻以9-0絲線固定于套管上。供肺以生理鹽水浸潤(rùn)的紗布包裹，置于冰水混合物上等待移植(圖3)。以微血管夾夾閉支氣管以防止保存液進(jìn)入氣道。

(3)受體手術(shù)

受體同樣方法全麻后，取右側(cè)臥位，剔除胸部毛發(fā)，70%乙醇消毒，經(jīng)左側(cè)第三肋間隙開(kāi)胸，牽開(kāi)胸廓，棉簽撥開(kāi)左肺，暴露并切斷左肺下韌帶，首先牽出左肺暴露肺門背面，肺動(dòng)脈位于肺門的頭側(cè)，支氣管位于中間，肺靜脈位于尾側(cè)，以棉簽鈍性分離周圍的脂肪組織，然后于肺門前面分離左肺動(dòng)靜脈及支氣管。于根部夾閉肺門，血管和氣管置9-0絲線待固定用。分別在肺動(dòng)靜脈及支氣管前壁開(kāi)一小切口，長(zhǎng)約1/4管徑。取出供肺，將肺動(dòng)脈套管經(jīng)切口插入受體肺動(dòng)脈，固定套管尾端以保持組織穩(wěn)定，以預(yù)置的 9-0絲線固定，同樣方式完成肺靜脈吻合和支氣管吻合，去除肺門夾鉗。(圖4)膨肺后查無(wú)損傷，5-0 絲線關(guān)胸，以30G鈍頭注射器抽出胸廓內(nèi)氣體，縫合皮膚。停止麻醉，受體蘇醒后放置暖箱內(nèi)吸氧恢復(fù)。1～2 h后即可恢復(fù)正?；顒?dòng)。

1.2.3病理組織學(xué)檢查

小鼠以氯胺酮 (50 mg/kg)/甲苯噻嗪(10 mg/kg)處死,獲取右肺和移植左肺，戊二醛固定，石蠟包埋。肺組織切片行HE染色觀察雙肺病理情況。

2結(jié)果

2.1手術(shù)效果

學(xué)習(xí)曲線后，共30例小鼠移植，手術(shù)成功率89%，小鼠成活率100%。供體手術(shù)時(shí)間：(35.2±9.81) min，受體手術(shù)時(shí)間：(24.6±7.42 )min，平均手術(shù)時(shí)間(59.8±17.32)min，冷缺血時(shí)間(46.6±8.92 )min，熱缺血時(shí)間(17.2±3.08) min。

注：a：套管模擬圖；b：自上而下依次是支氣管套管、肺靜脈套管、肺動(dòng)脈套管?！　D1　套管的制備Note.a：Cuff model；b：Top to bottom are the cuffs for bronchial, pulmonary vein, and pulmonary artery. 　　Fig.1　Preparation of the cuffs

圖2　離體的心肺組織塊　　Fig.2　The excised heart-lung block

圖3　套管固定后的供肺　　Fig.3　A donor lung after fixation with all cuffs

圖4　套管固定的供肺血管、支氣管與受體肺完成吻合　　Fig.4　Anastomosis of the donor pulmonary vein, pulmonary artery and bronchus with the recipient lung.

2.2移植肺大體及病理結(jié)果

同基因移植物隨時(shí)間增加大體無(wú)顯改變(圖5)，病理顯示移植肺結(jié)構(gòu)正常，肺泡通氣良好，與原肺無(wú)明顯差異(圖6)。

圖5　移植肺肉眼觀　　Fig.5　Macroscopic appearance of the graft lung

圖6　移植肺病理表現(xiàn)　　Fig.6　Histological appearance of the graft lung tissue.

3討論

肺移植患者長(zhǎng)期生存率低于許多實(shí)質(zhì)器官移植患者，然而對(duì)于肺移植后相關(guān)的生物學(xué)變化卻知之甚少，因此肺移植動(dòng)物模型的建立對(duì)于這一領(lǐng)域的研究具有重要的意義。1993年Hertz等[3]提出異位氣管移植模型，該模型反映了部分肺移植后生物學(xué)改變，并得到廣泛應(yīng)用，對(duì)肺移植后相關(guān)病理變化及相關(guān)機(jī)制的研究具有重要意義。此后科研工作者建立了原位氣管移植模型[4]、肺內(nèi)氣管移植模型[5]、原位肺移植模型[6]等，在這些模型中，原位肺移植模型最為符合生理，并接近人類肺移植過(guò)程，是研究肺移植的良好動(dòng)物模型。

大動(dòng)物原位肺移植模型操作方便，但大動(dòng)物特殊的飼養(yǎng)條件、高昂的費(fèi)用等限制了其應(yīng)用，因此嚙齒類動(dòng)物成為良好的選擇。而相對(duì)于大鼠，小鼠具有飼養(yǎng)方便、品系純正、遺傳背景明確的優(yōu)點(diǎn)，而基因敲除、轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用都極大地方便了研究。但是在小動(dòng)物中，傳統(tǒng)的吻合技術(shù)存在著操作困難、手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)、動(dòng)物死亡率高等缺點(diǎn)，而cuff套管技術(shù)的引入極大地方便了原位肺移植模型的建立[7]。本研究通過(guò)顯微外科采用cuff套管技術(shù)成功建立小鼠原位肺移植模型，為肺移植研究提供動(dòng)物模型。

該模型在制作過(guò)程中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①供肺灌注時(shí)壓力不宜過(guò)大，否則易造成肺水腫，導(dǎo)致移植后成活率下降；②小鼠體重在25～30 g較為適宜，低于25 g不利于操作，而高于30 g過(guò)多的脂肪組織影響操作的安全性；③由于肺靜脈部分膜組織和血管壁比較脆弱且易于剪切，分離支氣管與血管時(shí)，應(yīng)盡量使用銳性分離；④受體肺動(dòng)脈殘余外膜應(yīng)盡量清除以避免造成假道；⑤肺靜脈吻合是手術(shù)操作難點(diǎn)，因?yàn)榉戊o脈管壁菲薄，極易撕裂，應(yīng)先行套管；⑥受體氣管及血管切口應(yīng)小于供體套管直徑，切口過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致進(jìn)一步的撕裂；⑦套管固定位置的脂肪組織應(yīng)盡可能去除，否則可能導(dǎo)致管腔狹窄和感染的發(fā)生；⑧確保血管分離長(zhǎng)度足夠，周圍附著的脂肪和結(jié)締組織盡可能清除干凈，否則可能導(dǎo)致套管插入困難；⑨對(duì)于吻合位置出血，一般采用棉棒壓迫約5 min可止血；⑩要注意肺靜脈套管的位置和方向，避免氣管套管的壓迫，以免造成肺靜脈血流受阻；受體肺靜脈分支的位置和形狀存在變異，切口應(yīng)根據(jù)具體情況決定，如分叉較高，可選取共同開(kāi)口處進(jìn)行切開(kāi)。

本技術(shù)能夠方便快捷建立小鼠肺移植模型，成功率高，可重復(fù)性強(qiáng)，符合原位肺移植臨床生理，是研究肺移植后相關(guān)生物學(xué)變化及其機(jī)制的良好動(dòng)物模型。

參考文獻(xiàn)

[1]Hardy J, Webb W, Dalton M, et al. Lung homotransplantation in man [J]. Transplantation, 1964, 2(6): 811.

[2]Christie JD, Edwards LB, Aurora P, et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-sixth official adult lung and heart-lung transplantation report—2009 [J]. J Heart Lung Transplant, 2009, 28 (10): 1031-1049.

[3]Hertz M, Jessurun J, King M, et al. Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways [J]. Am J Pathol, 1993, 142 (6): 1945-1951.

[4]Ikonen TS, Brazelton TR, Berry GJ, et al. Epithelial re-growth is associated with inhibition of obliterative airway disease in orthotopic tracheal allografts in non-immunosuppressed rats[J]. Transplantation, 2000, 70 (6): 857-863.

[5]Dutly AE, Andrade CF, Verkaik R, et al. A novel model for post-transplant obliterative airway disease reveals angiogenesis from the pulmonary circulation [J]. Am J Transplantation, 2005, 5(2): 248-254.

[6]Okazaki M, Gelman AE, Tietjens JR, et al. Maintenance of airway epithelium in acutely rejected orthotopic vascularized mouse lung transplants [J]. Am J Resp Cell Mol Biol, 2007, 37 (6): 625-630.

[7]Mizuta T, Kawaguchi A, Nakahara K, et al. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1989, 97 (4): 578-581.

研究報(bào)告

Establishment of a mouse model of orthotopic lung transplantation

HE Shi-cai1, QIU Guang-lin1, WANG Ze-xing1, CHE Xiang-ming1, David S Wilkes2, QIAO Qiao1, LU Jing1, FAN Lin1

(1. Department of General Surgery, the First Affliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University,

Xi’an 710061, China; 2. Indiana University School of Medicine, Indianapolis U.S.A.)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the lung transplantation by establishing an orthotopic mouse lung transplantation model by microsurgery. Methods Thirty SPF male C57BL/6 mice served as both recipient and donor. Orthotopic lung transplantation models were established in the mice by three-cuff anastomotic technique. Native and transplanted lung tissue samples were taken at 7, 14, 21 and 28 days after transplantation for pathological evaluation of the outcomes using HE staining. ResultsAfter learning curve, 30 mice received transplantation. All mice survived and the success rate of lung transplantation was 89%. The donor operation time was 35.2±9.81 min and recipient operation time was 24.6±7.42 min. Mean cold ischemia time was 46.6±8.92 min, and warm ischemia time was 17.2±3.08 min. No histological alterations were routinely detected in the isograft lungs at all times post-transplantation compared with the native lungs. ConclusionsMouse lung transplantation model can be successfully established by the established technique with a high success rate and excellent reproducibility, and is in accordance with the physiology of clinical orthotopic lung transplantation. It is a good animal model for studying the pathogenesis and treatment of lung transplantation.

【Key words】Orthotopic lung transplantation; Animal model; Mouse

[收稿日期]2015-01-15

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2015.02.002

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847(2015) 02-0115-04

[通訊作者]樊林,男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：移植免疫。Email： linnet@mail.xjtu.edu.cn。

[作者簡(jiǎn)介]賀仕才(1987-)，男，博士，研究方向：器官移植。Email： hsc099@stu.xjtu.edu.cn。

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81270150)；陜西省科技研究國(guó)際合作項(xiàng)目(2012KW-41)。