康學東，張瀚文，余臣祖

(1.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院內分泌糖尿病科，甘肅 蘭州730020； 2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000)

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·實驗研究·

黃金膠囊對糖尿病大鼠血糖和肝細胞PI-3K、 GLUT-4蛋白表達的影響*

康學東1，張瀚文2，余臣祖2

(1.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院內分泌糖尿病科，甘肅 蘭州730020； 2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000)

摘要目的：觀察黃金膠囊對糖尿病大鼠肝細胞中磷脂酰肌醇3激酶( phosphatidylinositol-3-kinase,PI-3K)、葡萄糖轉運因子4( glucose transporter 4,GLUT4)的表達的影響。方法：選取48只SPF級大鼠，隨機抽取12只為空白對照組，其余給予高脂飼料和小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，并將模型大鼠隨機分為模型對照組、羅格列酮組和黃金膠囊組。大鼠造模成功2周后，羅格列酮組和黃金膠囊組分別灌胃羅格列酮(0.36 μg/g)和黃金膠囊(2.025 g/kg)，空白對照組和模型對照組灌胃生理鹽水(1 μL/g)，1 d 1次，連續(xù)10周。檢測空腹血糖及餐后2 h血糖；同時解剖大鼠取肝組織，行HE染色觀察大鼠肝臟病理組織變化，免疫組化染色觀察大鼠PI-3K和GLUT4 蛋白表達。結果：①與模型對照組對比，黃金膠囊組與羅格列酮組可降低糖尿病大鼠的血糖水平；與羅格列酮組對比，黃金膠囊組降糖效果較弱，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；②肝臟組織中PI-3K、GLUT4蛋白表達，空白對照組與其他各組對比，模型對照組呈現(xiàn)低表達，表達強度低于羅格列酮組和黃金膠囊組；羅格列酮組與黃金膠囊組對比，前者表達強度更強，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：黃金膠囊可提高肝細胞PI-3K和GLUT4 的蛋白表達。

關鍵詞黃金膠囊；糖尿病大鼠模型；磷脂酰肌醇3激酶；葡萄糖轉運子4；胰島素抵抗；動物；大鼠

現(xiàn)代醫(yī)學認為，胰島素通過信號轉導調節(jié)糖代謝和能量代謝。其中磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI-3K) 途徑被認為是胰島素信號轉導的經典途徑[1]，是胰島素在靶器官中信號轉導的主要通路之一。胰島素作用的靶器官在攝取、利用葡萄糖時是經一步一步蛋白結合、信號激活傳導下去的，即從胰島素受體(InsR)到胰島素受體底物-1(IRS-1)，再到PI-3K，最后傳遞至葡萄糖轉運因子4( glucose transporter 4,GLUT4)等一系列的信號轉導過程完成的[2]，從而來調節(jié)肝細胞、肌細胞以及脂肪細胞對葡萄糖的攝取與利用[3]。這些信號轉導過程的任何環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，均可能誘導胰島素抵抗的發(fā)生。黃金膠囊為甘肅中醫(yī)藥大學內部制劑，主要成分為黃連、雞內金，組方基于中醫(yī)學的解毒化濁法，取黃連清熱燥濕、瀉火解毒，雞內金運脾消食、護胃和中以達到解毒化濁的作用，自2006年被用于臨床以來，顯示出良好的降血糖作用。既往研究[4-5]證明，大劑量黃金膠囊可明顯改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用。本實驗是在此基礎上，進一步研究黃金膠囊改善胰島素抵抗的分子機制。

1材料與方法

1.1動物

SPF級雄性Wistar大鼠48只，4月齡，體質量(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學院動物實驗中心提供，動物質量合格證號：SCXK(甘) 2011-0001-0001365。

1.2藥品、試劑與儀器

黃金膠囊由黃連、雞內金組成，每粒膠囊4.5 g,含生藥量約4.0 g，由甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑科提供，批號1201101；羅格列酮，太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司產品，批號13010006。鏈脲佐菌素(streptozotoin，STZ)，美國Sigma公司提供，批號S0130-1G。PIK3CA免疫組化染色試劑盒(批號11CM231)、GLUT4免疫組化染色試劑盒(批號BA1351-1),均為武漢博士德生物工程有限公司產品；二抗，山羊抗兔免疫組化試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司，批號14188A03；免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司提供，批號11CM251。Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件，美國Media Cybemetics公司產品；BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分析圖像，成都泰盟科技有限公司產品；強生血糖儀，美國強生中國醫(yī)療器材有限公司產品。

1.3模型的建立、動物分組與給藥

參照Leng等[6]方法造模。設空白對照組12只,喂普通飼料；造模組36只，喂高脂飼料。4 w后，禁食12 h，將STZ按50 μg/g腹腔注射， 72 h后，禁食、不禁水12 h，尾靜脈采血，測量大鼠空腹血糖(FPG)、 口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)后2 h血糖。取FPG≥11.0 mmol/L、OGTT 2h≥16.7 mmol/L的大鼠歸入糖尿病模型對照組。將糖尿病模型大鼠隨機分為模型對照組、羅格列酮組和黃金膠囊組。大鼠造模成功2周后，羅格列酮組和黃金膠囊組分別灌胃羅格列酮(0.36 μg/g)和黃金膠囊(2.025 g/kg)，空白對照組和模型對照組灌胃生理鹽水(1 μL/g)，1 d 1次，連續(xù)10周。

1.4檢測指標

1.4.1FBG、OGTT 2h

灌胃10周后，采血，檢測FBG、OGTT 2h水平。

1.4.2肝臟組織病理學情況

取肝組織(肝左、右葉各一塊)，大小約2 mm×15 mm×10 mm；放于對應編號的廣口瓶中，加入40 g/L 多聚甲醛溶液固定24 h；常規(guī)石蠟包埋、切片(5 μm)；行HE染色，分別用10，40倍鏡頭電鏡下觀察HE染色及免疫組化染色。

1.4.3肝組織PI3K 、GLUT4蛋白表達

將染好的免疫組化標本片采用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分析圖像，測定GLUT4、PI3K平均光密度。

1.5統(tǒng)計學方法

2結果

2.1各組大鼠FBG、OGTT 2 h水平對比

各組治療前后對比，除空白對照組前后差別無統(tǒng)計學意義外，其余各組均有統(tǒng)計學意義。治療前，除空白對照組外，其余各組大鼠血糖間對比，差別均無統(tǒng)計學意義。治療后，與模型對照組對比，黃金膠囊組及羅格列酮組FBG、OGTT2h水平均降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；黃金膠囊組與羅格列酮組對比，后者降糖效果明顯，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1各組大鼠FBG、OGTT 2 h水平對比

注：與模型對照組治療后對比，*P<0.05；與黃金膠囊組治療后對比，#P<0.05。

2.2各組大鼠肝組織病理學情況對比

空白對照組大鼠肝細胞排列規(guī)則，質地均勻，可見成行排列的肝索細胞。模型對照組大鼠肝細胞排列不規(guī)則，質地不均勻，肝細胞內存在大小不等的脂滴。羅格列酮組大鼠肝細胞排列較規(guī)則，密度欠均勻，肝細胞內有大小不等的脂滴。黃金膠囊組大鼠肝細胞形態(tài)較規(guī)則，密度欠均勻，仍可見散在的大小不等的脂滴。見圖1。

2.3各組大鼠肝組織PI3K 、GLUT4蛋白表達對比

2.3.1各組PI3K蛋白表達情況

空白對照組大鼠肝組織中棕色區(qū)域提示PI3K陽性，陽性顯色細胞均為肝細胞，在肝細胞內棕色物均勻分布在細胞質及細胞膜上，其他細胞和肝細胞核內未見棕色陽性染色。模型對照組中目標蛋白主要分布在細胞膜及細胞質內，病變肝細胞中的脂滴內未見PI3K陽性染色，壞死肝細胞及炎性細胞內顯色為陰性，陽性染色細胞多集中在中央靜脈周圍，相同視野內陽性顯色面積較正常肝組織明顯減少。羅格列酮組陽性表達位置不變，分布以中央靜脈肝索周圍多見，相同視野內陽性顯色細胞分布不均勻，陽性表達較低于空白對照組，高于模型對照組。黃金膠囊組陽性表達特點同羅格列酮組，但陽性表達細胞數(shù)量及表達強度低于羅格列酮組，高于模型對照組。見圖2。

2.3.2PI3K陽性表達圖像分析

通過對切片圖像學分析，對平均光密度進行比較得出：與其他各組對比，空白對照組PI3K蛋白表達最強最明顯，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型對照組呈現(xiàn)低表達，表達強度低于羅格列酮組和黃金膠囊組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。羅格列酮組與黃金膠囊組對比，前者表達強度更強，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3各組大鼠肝組織PI3K蛋白表達

注：與空白對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05；與黃金膠囊組對比，ΔP<0.05。

2.3.3各組GLUT4蛋白表達情況

各組表達結果同PI3K表達結果位置特點均相同,表達強度與PI3K表達強度相同。見圖3。

2.3.4GLUT4陽性表達圖像分析

通過對切片圖像學分析，對平均光密度進行比較得出：與其他各組對比，空白對照組GLUT4蛋白表達最強最明顯，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型對照組呈現(xiàn)低表達，表達強度低于羅格列酮組和黃金膠囊組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。羅格列酮組與黃金膠囊組對比，前者表達強度強，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4各組大鼠肝組織GLUT4蛋白表達

注：與空白對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05；與黃金膠囊組對比，ΔP<0.05。

3討論

黃金膠囊由黃連、雞內金組成。黃連苦寒，歸心、脾、胃、膽、大腸經，功效清熱燥濕、瀉火解毒。黃連治療消渴首見于《名醫(yī)別錄》：“主五臟冷熱，久下泄膿血，止消渴……”。《本草經百種錄》云: “凡藥能去濕者必增熱，能除熱者，必不能去濕，惟黃連能以苦燥濕，以寒除熱，一舉兩得，莫神于此。”《本草正義》載:“黃連大苦大寒，苦燥濕，寒勝熱，能泄降一切有余之濕火，而心、脾、肝、腎之熱，膽、胃、大小腸之火，無不治之?！秉S連中的主要成分為小檗堿，其有改善胰島素抵抗、刺激胰島素分泌和降低血脂的作用；可以增加肝臟中過氧化物酶增殖體激活受體，并可上調肝臟胰島素誘導基因。還有研究表明：黃連中所含的生物堿可提高大鼠骨骼肌糖原儲存；增加糖尿病大鼠胰島素底物、葡萄糖轉運蛋白4，從而起到降低血糖的作用[7-9]。

中醫(yī)學認為：在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中，氣、血、津液運化失常，致水、濕、濁、痰、瘀等病理產物不斷積聚、凝結，產生具有毒害機體的產物，均可稱其為濁毒。濁毒既是一種對人體造成嚴重損害的致病因素，又是一種病理產物。濁毒互結，氣機不暢，痰濁膠著，毒不能散，血行受阻，長此以往，化生痰、濁、瘀血，耗傷臟腑氣血津液，從而造成濁毒內滯、脈絡痹阻、脾不升清、陰虛內熱的證機變化。痰濕的發(fā)病原因是由脾虛不能疏散水液，使水液聚集而成；而痰濕又可引起脾虛。脾虛濕盛日久，會導致陰虛濕痰瘀互結為患。脾虛日久積而生燥熱、熱又促進血瘀。痰濕熱為痰濕病機之演變。胰島素抵抗實質是濕、濁、毒等邪氣的聚積，由于患者脾弱而不能發(fā)揮其升清降濁、運輸水谷的作用，而發(fā)生脈道受阻，瘀血內生而化生為血濁。因此，血瘀、血濁與胰島素抵抗息息相關。黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒的作用，雞內金有消積化濁、健運脾胃的作用，二藥配伍，可達到解毒化濁、調氣活血的效果。

本研究表明：黃金膠囊具有降低DM大鼠模型空腹及餐后血糖的作用，可增加肝臟組織胰島素信號傳導通路中PI-3K和GLUT4蛋白的表達。此為中醫(yī)藥治療糖尿病胰島素抵抗奠定了基礎。

4參考文獻

[1]Taha C, Klip A.The insulin signaling pathway[J].J Membr Bio,1999,169(1):1-1.

[2]Wojtaszewski JF, Hansen BF, Kiens B, et al.Insulin signaling in human skeletal muscle:time course and effect of exercise[J].Diabetes,1997,46(11):1775-1781.

[3]姚潔，盛樹力，閔嶸，等.APP17肽對D-半乳糖老化小鼠海馬神經元IRS和PI3K表達的影響[J].中國藥理學通報，2007，23(1):95-99.

[4]崔慶榮, 安小平, 康學東, 等.黃金膠囊改善2型糖尿病胰島素抵抗大鼠胰島素感性研究[J].中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(5):150-152.

[5]余臣祖, 安小平, 康學東, 等.黃金膠囊對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響[J].中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(3):199-201.

[6]Leng SH, Lu FE, Xu LJ.Therapeutic effects of berberine in impaired glucose tolerance rats and its influence on insulin secretion[J].Acta Pharmacol Sin, 2004, 25(4):496-502.

[7]徐穎.黃連總生物堿的提取及其對實驗性糖尿病腎病大鼠的保護作用及機制的初步研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學，2006:36.

[8]徐穎，周世文，湯建林，等.黃連總生物堿對實驗性糖尿病腎病大鼠腎功能保護作用的研究[J].重慶醫(yī)學，2006,36(6):526.

[9]應懿.黃連生物堿的提取及其對實驗性糖尿病周圍神經病變和糖尿病肌病的保護作用及機制研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學，2007:27.

(編輯陶珠)

文章編號:1001-6910(2016)01-0050-05

中圖分類號:R587.1

文獻標志碼:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.01.24

作者簡介

康學東(1962-)，男(漢族)，甘肅蘭州人，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結合治療糖尿病及其并發(fā)癥。

通信作者：張瀚文，碩士研究生，653989343@qq.com

* 基金項目：2012年甘肅省科技廳科技計劃項目(1208RJZA179)

收稿日期：2014-12-08；修回日期：2015-11-17