何一昕　王雪晶　丁雪冰　梁東曉　潘鵬偉　劉丹丹　方艷博　滕軍放

鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內科　鄭州　450052

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·研究生園地·

突觸核蛋白病中α-syn聚集及播散的機制研究

何一昕王雪晶丁雪冰梁東曉潘鵬偉劉丹丹方艷博滕軍放△

鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內科鄭州450052

【關鍵詞】突觸核蛋白??；a-synuclein；包涵體；聚集；播散

突觸核蛋白病(α-synucleinopathy)是一類以大腦中不同類型α-突觸核蛋白(α-synuclein，簡稱α-syn)陽性包涵體為病理特征的神經(jīng)變性疾病，包括帕金森病、路易體癡呆、多系統(tǒng)萎縮及其他含α-突觸核蛋白病理的少見疾病。其中，帕金森病和路易體癡呆的標志是腦干或皮質Lewy小體，而多系統(tǒng)萎縮則表現(xiàn)為少突膠質細胞和神經(jīng)元的胞漿包涵體[1]。由于所有這些包涵體的主要成分均為α-突觸核蛋白，因此，α-突觸核蛋白的聚集和播散被認為是這些疾病發(fā)生及發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，引起大家廣泛關注。最近關于α-突觸核蛋白的研究逐漸增多，很大程度上提升了我們對突觸核蛋白病的發(fā)病機制的認識。本文中我們重點關注了近幾年來，對突觸核蛋白病中α-syn聚集及播散機制的研究進展。

1α-突觸核蛋白聚集體形成的機制

大家已廣泛接受神經(jīng)元內α-突觸核蛋白包涵體具有神經(jīng)毒性，α-syn的異常聚集是包涵體形成的關鍵步驟[2]。了解導致α-突觸核蛋白聚集的機制是解釋突觸核蛋白病發(fā)病的一個重要環(huán)節(jié)，并可能據(jù)此預防或抑制異常聚集體形成以促進新療法的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)[3]，在突觸核蛋白病中，有不同溶解度和不同分子量的α-syn聚集體。另外，A30P、E46K和A53T突變的存在也加速異常蛋白聚集形成纖維，提示影響α-syn內在結構的突變可導致其聚集增強[4]。越來越多的證據(jù)表明，包括翻譯后修飾和選擇性剪切等復雜機制的事件也與疾病相關[5]。目前為止，多種α-突觸核蛋白聚集機制已被提出。

1.1野生型α-突觸核蛋白的自身聚集α-突觸核蛋白生理狀態(tài)下主要以無結構或α-螺旋結構的形式存在，在腦組織中存在的主要生理形式是非折疊的單體形式[6]，在其單體形式時是不穩(wěn)定的，可自我組裝形成較穩(wěn)定的部分折疊的蛋白，導致可溶性寡聚體形成，之后進一步組裝形成富含β-片層的不溶性淀粉樣纖維[7]，上述過程在蛋白過量或應激條件下明顯增強，導致錯誤構象蛋白積累。富含β-片層錯誤構象的異常折疊蛋白能夠作為模板繼續(xù)引發(fā)更多正常構象的蛋白聚集。越來越多的研究證實，α-syn非纖維化二聚體或寡聚體是形成纖維聚集體或Lewy小體的中間媒介[8]。

在突觸核蛋白病中，含112個氨基酸的截短型α-syn(AS112)比含 140個氨基酸的全長型α-syn明顯較多[9]。這種C端截短型的α-syn是α-syn的一種最主要的選擇性剪切異構體，它保存了完整的膜蛋白和蛋白質結合域，是一種膜結合特性增強的聚集傾向較強的亞型，比全長蛋白更易聚集。在聚集早期，小部分與胞膜結合的α-syn募集了豐富的胞質內α-syn，并使其靶向至AS112的膜-蛋白質相互作用結構域，這是早期聚集步驟中的一個關鍵要素[5，9]。

對皮質路易小體的形成進行免疫顯微鏡觀察，根據(jù)其形態(tài)學變化可分為不同階段。第1階段，細胞質中顆粒狀α-syn在神經(jīng)細胞體中積累，隨后細絲狀α-syn的加入進入第2階段。第3階段，α-syn積累組成密集的顆粒細絲狀產(chǎn)生典型的圓形LBS。階段4的特點是樹突的參與。在階段5路易小體變形并形成松散的邊緣。最后，在階段6路易小體發(fā)生降解，表現(xiàn)為松散的絲狀元件，α-syn免疫反應性下降。大腦輕微的路易小體病理表現(xiàn)為新皮質中第1到第2階段的病理改變，而嚴重的LB病理表現(xiàn)為邊緣皮層中第5到6階段的病理改變[10]。

在對α-syn聚集形成包涵體的研究發(fā)現(xiàn)，多種蛋白可能與其相關，但具體分子機制未完全清楚。在突觸核蛋白病中包涵體形成的一個常見的早期事件為α-syn/rab3a的結合，借助rabphilin蛋白使α-syn與rab3a間接連接，而在正常大腦中未發(fā)現(xiàn)，提示rab3a可能在包涵體形成過程中起一定作用[11]。另一個包涵體的常見成分是氧化應激相關的泛素結合蛋白p62，它的免疫染色模式與泛素很相似，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)p62與泛素化蛋白的集合增強聚集過程相關[12]。在PD的腦干路易小體中，α-syn結合蛋白synphilin-1位于路易小體致密核心的絲狀及環(huán)狀結構中，可與E3泛素連接酶doffin物理連接并被泛素化，之后可與α-syn相互作用形成核心，促進α-syn的聚集和泛素化[13]。

體外研究發(fā)現(xiàn)，α-突觸核蛋白的自我低聚可以通過蛋白分子增加、膜的存在而啟動，并進一步發(fā)現(xiàn)可通過添加金屬離子、三氟乙醇、組織轉谷氨酰胺酶交聯(lián)、肝素或硫酸化糖胺聚糖、氧化應激、降低pH值、抑制蛋白酶體等方法誘導其聚集[2]。

1.2突變型α-突觸核蛋白的聚集機制雖然α-突觸核蛋白基因突變在PD中較少見，但與家族性PD的常染色體顯性遺傳相關，有助于闡明α-突觸核蛋白在細胞內的積累的分子機制。

與家族性PD相關的最常見點突變?yōu)锳53T、A30P、E46K突變，其突變位點均發(fā)生于包含4個不完全重復序列的氨基端(1-60)[14]，此區(qū)域易形成α-螺旋結構，被認為是介導蛋白質-膜、蛋白質-蛋白質相互作用的區(qū)域，此區(qū)域的突變因其重復序列改變易形成β-片層結構而容易聚集。另外，α-突觸核蛋白A53T點突變增強了多巴胺誘導的氧化損傷，有助于囊泡內多巴胺儲存和胞質中多巴胺的積累，促進氧化應激和代謝功能損傷，這些均可以提高α-突觸核蛋白聚集傾向[15]。A30P突變通過破壞α-突觸核蛋白與突觸小泡和脂筏的相互作用，導致α-突觸核蛋白遠離突觸前神經(jīng)終端，脂質膜結合缺陷，增強和加速α-突觸核蛋白的聚集并形成纖維[16]。E46K突變可能會導致與磷脂的結合增加，并增加纖維組裝速度[17]。

α-syn的SNCA基因三倍體突變可導致遺傳性早發(fā)性帕金森病癡呆，而SNCA二倍體突變也已經(jīng)在家族性帕金森病中被報道。SNCA二倍體類似原發(fā)性帕金森病，遲發(fā)性，進展緩慢，少伴癡呆，相比之下，SNCA三倍體為早期發(fā)病，進展迅速且多伴癡呆[18]。這些研究結果進一步支持，PD表型的嚴重程度與α-syn基因超量拷貝數(shù)有直接的關系。

點突變或基因倍增的α-syn寡聚體生成速度均加快，α-syn中的NAC區(qū)易形成β片層，為纖維形成提供成核部位，加速α-syn聚集。

1.3α-突觸核蛋白的翻譯后修飾

1.3.1α-突觸核蛋白的磷酸化：幾乎所有的突觸核蛋白病中都可檢測到α-syn磷酸化水平的升高，在體內可觀察到由酪蛋白激酶CK-1、CK-2介導的α-突觸核蛋白129位絲氨酸特異性和廣泛性的磷酸化[19]，提示廣泛的α-syn磷酸化可能是一個重要的致病事件，可能是包涵體形成的一個必要的步驟。突觸核蛋白病中超過90%的不溶性α-syn是磷酸化的，而正常α-syn中磷酸化的只有約4%，更加支持了這一假說。體外實驗也證實這種翻譯后磷酸化修飾的蛋白質體可促進纖維的形成。這個位點的α-突觸核蛋白磷酸化是受到生理刺激，包括應激，特別是增加紋狀體刺激后產(chǎn)生[20]，這暗示選擇性紋狀體刺激敏感性可能在突觸核蛋白病發(fā)病機制中起作用。

PD中的α-突觸核蛋白磷酸化局限于顳葉，而在DLB中更為廣泛，影響額葉和頂枕葉。在突觸核蛋白病的轉基因動物模型，α-突觸核蛋白基因突變體出現(xiàn)更大程度的磷酸化，尤其是A53T突變體，其次是A30P突變體，更進一步提示α-syn的廣泛磷酸化可能促進蛋白的聚集。

α-突觸核蛋白125位酪氨酸殘基可以被酪氨酸蛋白激酶Src家族，包括Src、Fyn以及p72syk磷酸化[21]。由于一些激酶的磷酸化作用(如Fyn)參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調節(jié)某些信號轉導通路的過程，在細胞分化、生存和可塑性中起作用，可能為磷酸化α-突觸核蛋白參與了這些神經(jīng)細胞的信號轉導通路。

1.3.2α-突觸核蛋白的硝化：硝化是另一個與α-突觸核蛋白聚集相關的修飾，對α-突觸核蛋白酪氨酸殘基的硝化是也通過氧化應激誘導的[22]。對α-突觸核蛋白125位的酪氨酸殘基的硝化易導致α-突觸核蛋白二聚化，而對39位酪氨酸殘基的硝化導致脂質囊泡的結合減少，從而提高α-突觸核蛋白分子的聚合能力。

1.3.3α-突觸核蛋白的泛素化：突觸核蛋白病中，蛋白包涵體可與抗泛素抗體發(fā)生免疫反應，提示其中的α-syn蛋白被泛素化修飾[23]。包涵體中α-syn蛋白的泛素化形式是單-泛素化和寡-泛素化的形式，而不是與蛋白酶體降解相關聯(lián)的多泛素化形式，提示α-syn的泛素化修飾可能也在其聚集過程中起一定作用。

2突觸核蛋白病中α-突觸核蛋白異構體播散的機制

為了使一種致病物質從一個細胞轉移到另一個細胞，并損傷受體細胞，病原體必須離開宿主細胞，到達受體細胞后，病原體必須穿過細胞膜以進入細胞，才能引起細胞應激或損傷受體細胞。研究表明，α-syn能夠完成上面列出的所有步驟，因此可以從一個細胞傳播到另一個細胞，遍及整個神經(jīng)系統(tǒng)。根據(jù)Braak等對不同病程PD患者的研究發(fā)現(xiàn)，在PD的不同病程階段，α-突觸核蛋白按照特定的順序在神經(jīng)系統(tǒng)內播散，為 α-syn在神經(jīng)系統(tǒng)中通過朊蛋白樣作用機制播散而導致發(fā)病的假說提供了一定理論依據(jù)。

2.1神經(jīng)元釋放α-突觸核蛋白的機制α-syn可以通過胞吐作用離開細胞。最初，我們發(fā)現(xiàn)，在腦脊液、血漿、唾液[24]中可檢測出來多種形式的α-syn，提示存在一種分泌過程。過表達α-syn的神經(jīng)母細胞瘤細胞和大鼠原代皮層元可分泌出單體和聚合形式的α-突觸核蛋白，并且這種分泌過程被低溫抑制，提示此過程為胞吐作用[25]。α-syn可定位到腔內囊泡中，進一步支持了胞吐的作用，而經(jīng)典的內質網(wǎng)/高爾基體依賴途徑可能不參與此過程。細胞應激，如血清剝奪、溶酶體酶抑制劑和過氧化氫等，可促進囊泡對α-syn的轉移和隨后的釋放。囊泡中獲得的α-syn比細胞中形成的α-syn顯示更多的氧化修飾，表明神經(jīng)元優(yōu)先釋放受損、有聚集傾向的α-syn[25]。

外泌體(exosomes)可能是突觸蛋白病中α-syn由細胞釋放的另一個途徑。外泌體是一種直徑為30～100 nm的小囊泡，起源于細胞內吞系統(tǒng)的晚期胞內體，可包含部分細胞漿，與細胞膜相融合釋放到細胞外。在其他神經(jīng)退行性疾病中，已經(jīng)證明其能夠傳播致病的朊蛋白、β-淀粉樣蛋白聚集體和磷酸化tau蛋白。研究，已發(fā)現(xiàn)，含有α-syn的外泌體可被神經(jīng)元細胞釋放至細胞間隙，并被其他神經(jīng)元攝取，并在其內形成陽性包涵體[26]。研究表明，包含α-突觸核蛋白的外泌體的分泌依賴于鈣離子的刺激。這種蛋白質的轉移過程可被囊泡外膜保護以免于胞外酶的損害。如果沒有外泌體外膜的保護，蛋白被降解的風險將明顯增加，已經(jīng)證實基質金屬蛋白酶3可降解重組α-syn 和神經(jīng)母細胞瘤細胞分泌的α-syn[27]。另外，死亡細胞的裂解并排出其內容物到細胞外空間可能導致不可控制的α-syn釋放。

2.2神經(jīng)元攝取α-突觸核蛋白的機制α-syn已被證明可直接與脂類和細胞膜反應。因此，細胞外α-syn蛋白能夠直接與細胞外膜聯(lián)系反應并相結合[28]。最簡單的方式是單體α-syn被動擴散通過細胞膜，這個過程對低溫和內吞作用的抑制不敏感，由于α-syn存在特別的疏水特性，此過程很可能僅被少量胞外蛋白限制。另外，結合到細胞膜外部的脂質或蛋白質的α-syn蛋白也可以通過膜蛋白的持續(xù)更新以非特異性的方式進入細胞。在HeLa細胞和酵母中，α-syn可與脂筏連接，脂筏處的蛋白質和脂類亞群較集中，從而在細胞表面產(chǎn)生信號平臺[29]。α-syn與脂筏中的一個重要組成部分——神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的反應，調節(jié)α-syn募集到這些結構[30]。神經(jīng)元細胞這種脂筏介導的內吞作用可調節(jié)原代神經(jīng)原細胞和小膠質細胞對細胞外α-syn的內化。

而細胞對低聚和纖維狀α-syn的攝取與單體的α-syn不同，通過更經(jīng)典的內吞過程進入細胞。對寡聚體和纖維狀的α-syn的攝取過程可被低溫和動力抑制劑減弱，使用胰蛋白酶處理細胞表面，以去除潛在的內吞受體蛋白，可抑制α-syn的吸收[31]。細胞外α-syn增多時，細胞攝取α-syn的能力可能增強，因為其可以通過攝入α-syn并將其降解掉以減少潛在的細胞外α-syn負荷的毒性。但只有當細胞處于健康狀態(tài)以足夠降解和清除致病性蛋白時，這種吸收和降解機制才能有效地工作，而一旦細胞受損，不足以清除α-syn蛋白時，導致其在細胞中聚集而致病。

如前所述，α-syn可通過外泌體釋放到細胞間隙，在細胞間轉運，并可通過內吞作用、受體-配體結合或與其他細胞的外膜融合等方式，將其內容物轉移到新的細胞中，不但能夠介導遠距離的α-syn的轉運，還可介導其他蛋白質、mRNA及micRNA等的轉運，是細胞間通信的有效途徑。

隧道納米管(TNTs)也可參與α-syn的傳播。隧道納米管存在于哺乳動物細胞內，是細胞間介導細胞訊息傳遞的一種線狀膜性管道，由細胞膜和以F-actin為主的細胞骨架成分構成，處于形成和斷裂的動態(tài)持續(xù)變化狀態(tài)中，可以介導遠距離的物質交換和運輸，如小分子、細胞器和囊泡的交換。已證明TNTs能在小鼠神經(jīng)元間傳遞朊蛋白(PrPSc)，隨后研究發(fā)現(xiàn)，隧道納米管中存在α-syn[32]，提示α-syn也可通過TNTs被神經(jīng)元攝取，進而在神經(jīng)元間播散。

另外，Braak假說提示存在遠距離傳播α-syn的方式，軸突運輸可以參與錯誤折疊的α-syn不同腦區(qū)之間的轉移。α-syn沿軸突的順行或逆行運輸，主要通過軸突運輸?shù)穆煞?、驅動蛋白和動力蛋白介導，有助于?syn沿軸突的雙向運動。另外，微流體培養(yǎng)系統(tǒng)證明α-syn可在軸突末梢釋放和攝取，提示跨突觸的細胞到細胞的傳輸。

3總結及展望

蛋白質異常聚集仍然是研究神經(jīng)退行性疾病的重要主題，α-syn在細胞中的聚集和細胞間的播散是突觸核蛋白病發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)，其機制較復雜，到現(xiàn)在仍未完全清楚，了解其分子機制有助于對此類疾病的發(fā)病機制進一步的認識。更重要的是，可能根據(jù)其聚集及播散路徑研發(fā)針對性的治療方案，如靶向細胞外α-syn的免疫治療可導致免疫系統(tǒng)對細胞外傳播的α-syn種子的去除，可能延緩α-syn在神經(jīng)系統(tǒng)內的播散。另外，對α-syn聚集體的特異性抑制劑的研究可能有重要意義，體外實驗證實，特異性結合α-syn負責自身聚集的區(qū)域的短肽可阻止試管中α-syn的寡聚化和纖維化[33]。由此看來，對α-syn聚集播散機制及其影響因素的研究可為疾病的預防及治療提供更有效的方法與建議，以延緩疾病的進展。

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(收稿2015-04-15 修回2015-12-20)

【中圖分類號】R741

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)04-0077-03

通訊作者：△滕軍放，主任醫(yī)師、教授、碩士及博士生導師，鄭州大學第一附屬醫(yī)院綜合醫(yī)學部主任，神經(jīng)內二科主任，中國醫(yī)師協(xié)會河南分會神經(jīng)內科專業(yè)協(xié)會會長，E-mail：tjf.6666@yahoo.com.cn