胡靜思，袁　榕，李守軍(廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642)

犬乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

胡靜思，袁榕，李守軍
(廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642)

摘要:【目的】建立方便、經(jīng)濟(jì)的犬乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，用于犬乳腺癌的研究.【方法】以新產(chǎn)犬乳汁為材料，離心并收集乳汁中細(xì)胞，進(jìn)行分離培養(yǎng).用CCK-8法繪制細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞角蛋白8免疫熒光染色鑒定上皮細(xì)胞.【結(jié)果和結(jié)論】試驗(yàn)材料培養(yǎng)后第3天即可見島嶼狀的細(xì)胞克隆并伴有少量吞噬細(xì)胞.繼續(xù)培養(yǎng)至單克隆細(xì)胞匯合后，可見細(xì)胞呈典型的石鋪路狀，單層平鋪生長，且在細(xì)胞表層產(chǎn)生乳滴，細(xì)胞傳代后吞噬細(xì)胞消失.CCK-8結(jié)果顯示，細(xì)胞生長曲線呈“S”型.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞角蛋白8呈陽性.表明從犬乳汁中可以分離培養(yǎng)出高純度、生長迅速的犬乳腺上皮細(xì)胞.本試驗(yàn)建立了短時間內(nèi)獲得大量純?nèi)橄偕掀ぜ?xì)胞的方法.

關(guān)鍵詞:犬乳汁;乳腺上皮細(xì)胞;體外培養(yǎng);角蛋白8;

胡靜思，袁榕，李守軍，等.犬乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(6):35-38.

優(yōu)先出版時間:2015-10-16

優(yōu)先出版網(wǎng)址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151016.1356.002.html

乳腺腫瘤是母犬最常發(fā)的腫瘤，且一半以上為惡性腫瘤［1］.乳腺是復(fù)管泡狀腺，其功能的主要承擔(dān)者是乳腺上皮細(xì)胞.乳腺上皮細(xì)胞的增殖和分化貫穿整個乳腺發(fā)育周期的始終［2］.研究表明，大多數(shù)乳腺癌的發(fā)生都與乳腺上皮細(xì)胞關(guān)系密切［3-4］.成功地對犬乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)是研究犬乳腺腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、癌變的關(guān)鍵［5］.因此，建立簡單易行的犬乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法至關(guān)重要.早在1957年，Lasfargues［6］就已經(jīng)利用膠原酶從成年小鼠乳腺組織中成功分離出了乳腺上皮細(xì)胞.此后，人們對不同動物，如牛、羊、小鼠、兔等乳腺上皮細(xì)胞的離體培養(yǎng)進(jìn)行了研究，其技術(shù)日趨成熟，并獲得了成品的乳腺上皮細(xì)胞系［7-9］.然而，犬的乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)在國內(nèi)外鮮有報(bào)道，其分離培養(yǎng)方法仍需要進(jìn)一步探究.本試驗(yàn)從犬初乳中分離犬乳腺上皮細(xì)胞，并對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長以及形態(tài)，利用細(xì)胞免疫組化對所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定，成功建立了一種簡單易行、經(jīng)濟(jì)快速獲得大量高純度犬乳腺上皮細(xì)胞的方法.

1　材料與方法

1.1材料

泌乳期健康比格犬，年齡2歲，飼養(yǎng)于廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.

主要試劑: D-MEM /F-12(11320-033，Gibico)、胎牛血清(10099-141，Gibico)、胰蛋白酶(25200-072，Gibico)、青霉素－鏈霉素(15140-122，Gibico)、氫化考的松(Sigma)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma)、表皮生長因子(Sigma)、鼠抗人角蛋白8單克隆抗體(BM0032，BOSTER)等.

主要儀器:超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、離心機(jī)等.

1.2方法

1.2.1乳汁的采集及細(xì)胞分離與培養(yǎng)用無菌生理鹽水清洗乳房，再用酒精棉球擦凈乳頭.將乳汁擠入15 mL滅菌離心管中.放入37℃保溫盒備用.將乳汁與含雙抗的PBS按適宜比例混勻后，1 000 r·min－1離心5 min.此時可見離心管內(nèi)混合液分為3層.小心吸出最上層乳脂層和中間層，然后再加入含雙抗的PBS繼續(xù)洗滌.如此重復(fù)直至離心后液體澄清透明.將最下層的細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至適宜的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng).3 d后換液，待細(xì)胞長出單克隆后原瓶消化，直至細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%以上，消化傳代，并凍存.

1.2.2 CCK-8法繪制細(xì)胞生長曲線選擇第7代細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用臺盼藍(lán)染色，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù).按103～104mL－1的細(xì)胞接種于96孔板.置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng).分別于培養(yǎng)后24、48、72、96 h以及5、6、7 d后，吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2遍，加入培養(yǎng)液及體積分?jǐn)?shù)為10% 的CCK-8溶液(KeyGEN)，于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育1～4 h.酶標(biāo)儀450 nm處檢測每孔的D值.每組3個重復(fù)并設(shè)置陰性對照和空白對照.用下式計(jì)算細(xì)胞存活率，繪制生長曲線.

1.2.3細(xì)胞角蛋白8免疫熒光鑒定復(fù)蘇凍存的細(xì)胞進(jìn)行爬片，用體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定，PBS洗滌3次，每次5 min.用體積分?jǐn)?shù)為0.2%的TritonX-100處理細(xì)胞5 min，PBS洗滌3次.正常山羊血清封閉30 min后洗滌.加入按體積比1∶100稀釋鼠抗人角蛋白8單克隆抗體(BOSTER)作為一抗，4℃孵育過夜.洗滌后，加入按體積比1∶100稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠二抗(Millipore)，孵育30 min.PBS洗滌3次，每次5 min.使用DAPI染色液(Sigma)室溫染色10 min.在熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果.

2　結(jié)果與分析

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

從乳汁中分離的細(xì)胞接種培養(yǎng)3 d后，此時已可見許多島嶼狀的細(xì)胞克隆和分散的呈不規(guī)則形狀的上皮細(xì)胞(圖1A).細(xì)胞島嶼周圍見明顯的生長暈.換液后繼續(xù)培養(yǎng)，可見細(xì)胞逐漸增殖、平鋪，待長至第9天時即可見形成許多大的單克隆，細(xì)胞形態(tài)較為單一，單層平鋪生長，以多邊形和長梭形細(xì)胞為主.此時已少見吞噬細(xì)胞的存在(圖1B).細(xì)胞在分裂增殖的過程中仍可見乳滴的分泌(圖1C).原瓶消化細(xì)胞，使單克隆細(xì)胞分散，繼續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)多核細(xì)胞，吞噬細(xì)胞完全消失(圖1D).3 d后細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80%以上，傳代凍存.復(fù)蘇后的細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)出現(xiàn)多種形態(tài)的細(xì)胞:多邊形的細(xì)胞(圖1E)、長形的細(xì)胞(圖1F)、蜂窩狀細(xì)胞(圖1G).細(xì)胞開始分泌大量乳滴(圖1H).細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底后不傳代繼續(xù)培養(yǎng)的，至鋪滿瓶底進(jìn)入生長停滯期，此時細(xì)胞增殖不明顯，細(xì)胞之間出現(xiàn)拉網(wǎng)現(xiàn)象(圖1I)，此狀態(tài)的細(xì)胞在換液的情況下，可維持生長3周以上，傳代后仍可正常增殖.

2.2 CCK-8繪制細(xì)胞生長曲線

取凍存第7代的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，繪制細(xì)胞生長曲線(圖2).細(xì)胞在第1至3天時生長較為緩慢.第3天以后進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞快速增殖.第6天以后細(xì)胞活力逐漸下降.表明所培養(yǎng)的細(xì)胞具有正常細(xì)胞增殖特性.

圖1　犬乳汁中上皮細(xì)胞培養(yǎng)不同時間的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1　 Morphological observation of the canine mammary epithelial cells cultured in different periods

圖2　犬乳腺上皮細(xì)胞生長曲線Fig.2　 A growth curve of the canine mammary epithelial cells

2.3犬乳腺上皮細(xì)胞的鑒定

同樣取凍存第7代細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，爬片固定后進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定.熒光顯微鏡下觀察可見，細(xì)胞核在激發(fā)光照射下顯示藍(lán)色.一抗孵育呈陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)在激發(fā)光照射下顯示綠色.細(xì)胞角蛋白8在分離培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)均成陽性(圖3).表明所分離的乳腺細(xì)胞的確為乳腺上皮細(xì)胞.

圖3　免疫組化鑒定細(xì)胞角蛋白8Fig.3　 Cytokeratin 8 identified with the immunohistochemical assay

3　討論與結(jié)論

分離培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞最常用的方法是酶消化法.本試驗(yàn)在用乳汁分離培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞的同時，也試圖用膠原酶消化犬乳腺組織來培養(yǎng)犬乳腺上皮細(xì)胞，但是效果并不理想.細(xì)胞中有大量的成纖維細(xì)胞污染，很難得到純凈的乳腺上皮細(xì)胞.且所獲得乳腺上皮細(xì)胞狀態(tài)較差，增殖能力較弱，這與鄭玉才［10］的研究結(jié)果一致.究其原因可能是因?yàn)橛萌橄俳M織培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞對所取樣品的要求高，必須要求所用動物乳腺健康且所取乳腺組織無其他組織殘留;酶消化的時間和程度較難把握，且酶的作用對細(xì)胞的損傷較大.因此，采用酶消化法從組織中分離乳腺上皮細(xì)胞方法復(fù)雜、技巧性高、耗費(fèi)時間，而且很難純化［11］.

動物在泌乳期時，大量乳腺上皮細(xì)胞脫落，隨著乳汁排出.許多研究者認(rèn)為從乳汁中分離乳腺上皮細(xì)胞成功率較低［12］.本研究發(fā)現(xiàn)，乳汁中分離乳腺上皮細(xì)胞成功的關(guān)鍵是取材和操作，具體包括: 1)要選擇哺乳早期的犬進(jìn)行乳汁采集，一般在1周內(nèi)為宜; 2)采集乳汁的過程中應(yīng)注意無菌操作，盡量減少污染的可能性; 3)收集到的乳汁應(yīng)立即放在37℃保溫盒中保存，并盡快進(jìn)行后續(xù)處理.這對于保持細(xì)胞的活力至關(guān)重要; 4)用加雙抗的PBS對乳汁進(jìn)行洗滌，吸出上層乳脂層時一定要緩慢操作，小心不要將下層細(xì)胞沉淀吸出，采集足夠量的細(xì)胞是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵; 5)在細(xì)胞貼壁后長出大面積克隆時，應(yīng)進(jìn)行一次原瓶消化，此步驟保證新長出的細(xì)胞克隆不會衰老，有助于細(xì)胞進(jìn)一步的增殖; 6)細(xì)胞傳代過程中，傳代細(xì)胞長至3～4 d即可長滿，如遇細(xì)胞密度較低的情況，可能在細(xì)胞沒有鋪滿的情況下細(xì)胞就會出現(xiàn)衰老，此時應(yīng)時刻觀察細(xì)胞生長，在細(xì)胞衰老之前及時傳代.

相對于酶消化法來說，從乳汁中分離乳腺上皮細(xì)胞的方法簡便、經(jīng)濟(jì)、快捷，不需要復(fù)雜的操作方法和試劑.所得的細(xì)胞中除了乳腺上皮細(xì)胞，僅有吞噬細(xì)胞存在.吞噬細(xì)胞本身的貼壁增殖能力弱，容易自發(fā)死亡，經(jīng)1次傳代后即可得到高純度的乳腺上皮細(xì)胞.所得的乳腺上皮細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，生長迅速.細(xì)胞傳至10代以上，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞老化，其形態(tài)、生長速度均未出現(xiàn)明顯變化.

角蛋白8是存在于上皮細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)蛋白，是乳腺上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白.本試驗(yàn)用鼠抗人角蛋白單克隆抗體作為一抗，復(fù)蘇第7代凍存細(xì)胞進(jìn)行爬片固定，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)，從犬乳汁中分離出的細(xì)胞角蛋白8呈陽性.

CCK-8法繪制的細(xì)胞生長曲線表明，從犬乳汁中可分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有正常的分裂增殖的能力.利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及細(xì)胞免疫熒光的方法鑒定所得細(xì)胞為乳腺上皮細(xì)胞.表明從犬乳汁中可以分離培養(yǎng)出純凈的犬乳腺上皮細(xì)胞，所得細(xì)胞生長旺盛，增殖迅速.

本研究從犬乳汁中分離出了犬乳腺上皮細(xì)胞.建立了體外培養(yǎng)犬乳腺上皮細(xì)胞的方法.該方法操作簡單、快捷、經(jīng)濟(jì)，且能有效地避免乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中面臨的成纖維細(xì)胞污染以及酶處理造成細(xì)胞損傷的問題，在短時間內(nèi)即可大量獲得純凈的犬乳腺上皮細(xì)胞，為乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)提供了有效的方法，也為研究犬乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了素材.

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【責(zé)任編輯周志紅】

Culture and identification of mammary epithelial cells in canine milk

HU Jingsi，YUAN Rong，LI Shoujun
(Key Laboratory of Comprehensive Prevention and Control for Severe Clinical Animal Diseases of Guangdong Province /College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Abstract:【Objective】To establish an in vitro model of canine mammary epithelial cells for the study of the carcinogenesis and development of breast cancer.【Method】The cells were separated from canine milk and cultured.The cell growth curve was described using the CCK-8 assay.The expression of cytokeratin 8 was determined using cell immunofluorescence to identify mammary epithelial cell.【Result and conclusion】After cultured for 3 days，the cells were cloned with a shape like a typical island，and there were also a few phagocytes.Cultured for a few more days，the cells began to coalesce and form monolayers which could secrete lactogenesis drops.The phagocytes vanished after several passages.The cell growth curve was similar to a“S”shape.The immunofluorescent staining results showed that the cell of cytokeratin 8 was positive.The results indicated that the canine mammary epithelial cells separated from canine milk were highly pure and rapidly growing.This study established a model to isolate and culture massive canine mammary epithelial cells in a short time.

Key words:canine milk; mammary epithelial cell; in vitro culture; cytokeratin 8

基金項(xiàng)目:廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2013A061401013) ;公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303042) ;促進(jìn)科技服務(wù)業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013B040200032) ;高級獸醫(yī)外科與外科手術(shù)學(xué)示范課程(NO.12sfkc05)

作者簡介:胡靜思(1990—)，女，碩士研究生，E-mail: hjsluobo@163.com;通信作者:李守軍(1968—)，男，教授，博士，E-mail: shoujunli@ scau.edu.cn

收稿日期:2015-02-06

文章編號:1001-411X(2015) 06-0035-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:S857.4