朱　敏，邵　彪，龐　峰，趙岐剛

(聊城市人民醫(yī)院 檢驗科,山東 聊城252000)

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碳青霉烯酶檢測方法的研究進展

朱敏，邵彪，龐峰，趙岐剛*

(聊城市人民醫(yī)院 檢驗科,山東 聊城252000)

近年來產(chǎn)生了許多碳青霉烯酶耐藥的革蘭氏陰性桿菌，如腸桿菌科細菌，銅綠假單胞菌及不動桿菌屬。碳青霉烯類抗生素是抵抗細菌侵犯的最后一道屏障，大量耐碳青霉烯酶菌株的出現(xiàn)導致臨床面對多重耐藥或者泛耐藥細菌無藥可用，對廣大病患造成了不可挽回的損失。因此在臨床工作中快速檢測出碳青霉烯酶，通過有力措施預防其迅速的播散，才可為臨床治療提供有力的保障。碳青霉烯酶的檢測方法不斷改進完善，出現(xiàn)了改良Hodge實驗、PCR檢測、CarbaNP檢測、紫外分光光度法、MALDI-TOF質譜分析法等，本篇文章就碳青霉烯酶及碳青霉烯酶的檢測方法加以簡述，為檢驗工作者選擇檢測碳青霉烯酶的方法提供參考。

1　碳青霉烯酶

碳青霉烯酶是一類可以水解碳青霉烯酶類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶，它包括Ambler分子結構分類的A、B、D三類酶。其中A類、D類為絲氨酸酶，B類酶為金屬酶。A類酶包括由質粒介導的KPC-1、KPC-2、GES-2，由染色體介導的NMC-A、IME-1、SME-1、SME-2、SME-3，主要見于肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、黏質沙雷菌等腸桿菌科類的細菌中。A類酶的活性可以被克拉維酸或者他唑巴坦所抑制，對EDTA不敏感[1，2]。B類金屬酶分布廣泛，可被EDTA抑制。1989年Bush[3]首次將該酶歸類為金屬β-內(nèi)酰胺酶。可分為天然金屬酶及獲得性金屬酶，獲得性金屬酶有5個不同的基因家族即IMP、VIM、SIM-1、SPM-1和GIM-1。IMP家族多數(shù)由IMP-1基因突變產(chǎn)生，可以水解除氨曲南之外的β-內(nèi)酰胺類抗生素，也不會被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制[4-5]。我國檢出的類型主要是IMP-4、IMP-8、IMP-9。VIM-2型金屬酶對碳青霉烯類抗生素水解活性最強，銅綠假單胞菌是VIM型金屬酶主要攜帶者[6]。SPM-1是近年發(fā)現(xiàn)金屬酶，其編碼基因由一種新型的基因原件攜帶，通過基因重組作用介導這一類型的酶在細菌之間傳播。SIM-1和GIM-1這兩種金屬酶比較少見，SIM型金屬酶主要在韓國流行，而GIM型金屬酶只在德國的幾個城市傳播。D類碳青霉烯酶主要存在于不動桿菌屬中，對苯唑西林的水解能力很強，又稱OXA酶。這類超廣譜β內(nèi)酰胺酶(CHDLs)被劃分為OXA-23、OXA-40、OXA-51、OXA-58、OXA-143五組，以OXA-23為主，其次是OXA-48和OXA-50。blaOXA-51在野生型的菌株中不表達，但是在其5末端插入ISAba1序列后可以導致相應的β內(nèi)酰胺酶的過表達[7]。OXA酶可以在不同的菌株中播散主要依賴于質粒或者轉座子[8]。

2　碳青霉烯酶檢測方法

我們?nèi)粘９ぷ魍ㄟ^藥物敏感試驗來確定菌株是否有碳青霉烯酶產(chǎn)生，以美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)制定的碳青霉烯類抗生素折點來判斷，但是需要花費36-48h甚至更長的時間，而且有的菌株并不表現(xiàn)出明顯的碳青霉烯類抗生素耐藥的改變，這就需要通過實驗室檢測確定菌株是否產(chǎn)生了碳青霉烯酶[9]。

2.1改良Hodge實驗

改良Hodge試驗(modifiedHodgetest，MHT)是CLSI在2009年推薦的檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶表型的常規(guī)方法。MHT法操作簡便，微生物室一般都可以開展，因此被廣泛用于產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌的表型檢測。具體步驟CLSI制定的藥敏標準中有述。改良Hodge試驗還可以用來檢測銅綠假單胞菌及不動桿菌屬中產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株，但是敏感性及特異性比較低。檢測金屬β內(nèi)酰胺酶如產(chǎn)IMP、VIM、NDM的菌株或者是產(chǎn)KPC的菌株需要抑制菌株的一些分子性能，這就需要專門知識并且需要較長的時間大約需24-48h。如果要檢測OXA-48這一流行廣泛的碳青霉烯酶，卻沒有任何的抑制劑可以使用[10-11]，所以改良Hodge實驗檢測碳青霉烯酶有它的局限性，且易產(chǎn)生假陰性。

2.2CarbaNP檢測

隨著耐碳青霉烯酶菌株所含耐藥基因的日趨復雜，傳統(tǒng)的檢測方法特異性及敏感性受到挑戰(zhàn)，檢測產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的方法有待革新。2012年PatriceNordmann[10]領導的團隊提出了檢測碳青霉烯酶的新方法稱為CarbaNP法。2015 年CLSI藥敏試驗標準引入CarbaNP試驗檢測碳青霉烯酶。CarbaNP確證試驗是一種腸桿菌科、銅綠假單胞菌和不動菌屬細菌中碳青霉烯酶的表型檢測方法，主要是基于碳青霉烯酶可以水解亞胺培南分子中的β內(nèi)酰胺環(huán)使其氫鍵斷裂，導致pH值降低使反應液的指示劑發(fā)生顏色的改變這一原理。CarbaNP檢測方法又可以分為CarbaNP實驗Ⅰ和CarbaNP實驗Ⅱ

2.2.1CarbaNP實驗Ⅰ取一環(huán)(約10μl)待測菌重懸于200μl20mmol/LTris-HCl裂解緩沖液中，混懸1min，室溫孵育30min。10000g離心5min，取30μl上清加入到反應液中。反應液體系為100μl，包含0.3mg的亞胺培南西司他丁，0.1mmol/LZnSO4，以酚紅溶液為溶劑。酚紅溶液配置是0.5%的酚紅母液2ml加入16.6ml的超純水。反應體系置于37℃孵育2h，期間可以不斷觀察顏色變化。如果細菌產(chǎn)生碳青霉烯酶則顏色逐漸變?yōu)殚偌t色或者黃色。

2.2.2CarbaNP實驗Ⅱ碳青霉烯酶分為A，B，D三組，A組絲氨酸碳青霉烯酶，其活性可以被克拉維酸或者他唑巴坦抑制；B組酶金屬β內(nèi)酰胺酶，其活性可以被EDTA抑制；D組酶的活性不被酶抑制劑和EDTA抑制[12]。以這三組酶的特點我們可以衍生出CarbaNP實驗Ⅱ。我們可以設置三個孔，A孔加酶抑制劑，B孔加EDTA，C孔不加任何抑制劑。將同一菌株的裂解液分別加入這A、B、C這三個孔，如果A孔顏色不改變而B、C孔顏色改變則為A組酶，如果B孔顏色不改變而A、C孔顏色改變則為B組酶，如果A、B、C三孔顏色均改變則為D組酶。

CarbaNP檢測方法可以很好的將碳青霉烯酶介導的耐藥同其他機制介導的耐藥區(qū)分，這些機制有頭孢菌素酶過表達相關的細胞外膜通透性的缺陷、產(chǎn)生超廣譜的β內(nèi)酰胺酶，也可以將那些表達超廣譜β內(nèi)酰胺酶但是沒有碳青霉烯酶活性的碳青霉烯酶易感菌株區(qū)分開來。CarbaNP法檢測腸桿菌科和銅綠假單胞菌敏感率分別為91.1%和94.4%，特異性均為100%[13-14]。CarbaNP檢測法具有多種優(yōu)點：快速、重復性好、費用低、敏感性及特異性高，技術含量低，可以在普通的實驗室開展此項試驗，實現(xiàn)碳青霉烯類抗生素耐藥菌株的快速篩查。

2.3CarbAcinetoNP

導致不動桿菌屬耐藥的碳青霉烯酶主要是超廣譜β內(nèi)酰胺酶，為D組酶。改良的Hodge實驗已經(jīng)用來鑒定碳青霉烯酶耐藥的不動桿菌，此實驗是基于檢測碳青霉烯酶體外的活性，這一實驗可以鑒定IMP及VIM，但是檢測不到NDM及CHDL，故導致了一些假陰性菌株的產(chǎn)生，且敏感性及特異性均不高。由于不動桿菌屬本身較低的滲透性，通過CarbaNP檢測鑒定碳青霉烯酶耐藥的不動桿菌屬比鑒定腸桿菌科細菌及銅綠假單胞菌要困難一些，可以檢測出不動桿菌屬中的金屬β內(nèi)酰胺酶，卻檢測不出超廣譜β內(nèi)酰胺酶(CHDLs)。2014年LaurentDortet[15]將CarbaNP檢測方法稍改變一下用來檢測耐碳青霉烯酶的不動桿菌屬，稱為CarbAcinetoNP檢測。將CarbaNP檢測方法中蛋白裂解液改為5MNaCl，以減少蛋白裂解液對實驗的影響,并且所用菌量增加一倍以增加酶的含量，亞胺培南的濃度由3mg/ml增加到6mg/ml，其余不變。CarbAcinetoNP檢測可以檢測出不動桿菌屬中所有的碳青霉烯酶，敏感性94.7%，特異性100%[15-16]。

2.4紫外分光光度法

2012年BernabeuS[17]團隊用紫外分光光度法檢測腸桿菌科中碳青霉烯酶。其原理也是檢測碳青霉烯酶對亞胺培南的水解來區(qū)分產(chǎn)酶株與非產(chǎn)酶株。臨床分離的致病菌株接種到10ml胰蛋白胨大豆肉湯中，37℃搖床孵育18h。取1.5ml菌液15 000g離心10min,去掉上清加入500μl0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，含50μmol/LZnSO4，重懸所收集的細菌。放置于冰面1min,超聲裂解1min,4℃、15 000g離心10min。上清用來做分析。紫外分光光度儀采用297nm的波長，電腦檢測使用SWIFT2軟件分析。石英比色杯中加入970μl0.1mol/L磷酸鹽緩沖液內(nèi)有50μmol/LZnSO4，15μl酶的粗提液，15μl10mmol/L亞胺培南，反應持續(xù)10min。比較每分鐘混合液中的亞胺培南水解的吸收峰和單純亞胺培南降解的吸收峰，陽性結果cutoff值為(5-10)-4。這一方法的敏感率100%，特異性為98.5%。需要專業(yè)培訓的技術人員，耗費時間長，但是花費比較低，紫外分光光度儀及超聲裂解儀的價位均不高，普通的實驗室中亦可以配備。

2.5MALDI-TOF質譜分析法

基于MALDI-TOF生物質譜的組織成像技術 (MALDI-imagingmassspectrometry，MALDI-IMS)是一門新興的分子成像技術，對于發(fā)現(xiàn)疾病生物標志物和研究藥物代謝等方面具有重要意義，并具有良好的臨床應用前景。BurckhardtI[18]和HrabakJ[19]帶領各自的團隊采用MALDI-IMS這一技術檢測腸桿菌科及銅綠假單胞菌產(chǎn)生碳青霉烯酶，他們是通過檢測美羅培南及厄他培南的代謝變化，敏感度是96.67%，特異性為97.87%。KempfM[20]等人則采用MALDI-IMS這一技術檢測不動桿菌屬中碳青霉烯酶，他們是通過檢測亞胺培南的代謝變化，這是首次提及用此方法檢測耐碳青霉烯酶的不動桿菌屬，并且敏感度及特異性均為100%。LeeW,ChungHS[21]等在2013年采用MALDI-TOF質譜分析法檢測了IMP-6、VIM-2、NDM-1、SIM-1、KPC-1、OXA-23、OXA-51 型的碳青霉烯酶。采用過夜培養(yǎng)的目的菌株一環(huán)(約10μl)加入1ml緩沖液中(0.1mMTris-HCl或者0.45%NaCl),一管中加入0.5g/L碳青霉烯類抗生素(IMP、MEM、ETP)，一管不含為對照管。兩管均孵育約3h,12 000g離心90s,各取1μl上清加入靶板，干燥后每孔加入1μl基質液上機檢測。通過檢測碳青霉烯類抗生素的峰值變化來確定是否為產(chǎn)霉菌株。MALDI-TOF質譜分析這一檢測方法所需時間為4h左右，能快速的檢測碳青霉烯酶。雖然敏感度和特異性很高但是這一技術花費很高，普通的微生物實驗室很難配備，同時需要專業(yè)的技術人員。

2.6PCR實驗

采用PCR檢測碳青霉烯酶仍是常用的方法，但是PCR實驗的費用比較高，需要專業(yè)技術人員，耗時也較長，且PCR只能檢測已知的碳青霉烯酶，無法發(fā)現(xiàn)新的酶。

2.7基因測序

基因測序檢測碳青霉烯酶不常用，測序花費高，耗時長，需要專業(yè)技術人員，一般實驗室無法完成。我們采用測序的方式是通常在PCR實驗后，這樣我們可以發(fā)現(xiàn)新的基因突變點。

綜上所述，多重耐藥泛耐藥的革蘭氏陰性桿菌特別是腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌及不動桿菌屬已經(jīng)遍布世界，碳青霉烯類抗生素是治療這些細菌的最后一道屏障，但是碳青霉烯類抗生素耐藥的細菌越來越多，碳青霉烯酶耐藥基因可以質?；蛘咿D座子的形式迅速播散，這就需要我們醫(yī)務人員采用最快最有效的方法檢測到它們的存在。碳青霉烯酶的檢測方法不斷的演變完善，我們目前工作中最常用的是MHT檢測方法，但是這一檢測方法的特異性及敏感性不高，并且一些特殊的碳青霉烯酶的表型不能檢測到，易造成假陰性。MALDI-TOF質譜分析儀是新興的一種檢測儀器，BurckhardtI和HrabakJ帶領各自的團隊證實了我們可以通過這一檢測儀器檢測陰性桿菌中碳青霉烯酶，敏感度是96.67%，特異性為97.87%。這一檢測儀器在大型綜合醫(yī)院很多都已經(jīng)配備，我們完全可以采用這一方法來檢測碳青霉烯酶的產(chǎn)生。2012年PatriceNordmann領導的團隊首次提出了carbaNP檢測方法。這一檢測方法可以很好地檢測到陰性桿菌中的碳青霉烯酶，并且可以根據(jù)一些抑制劑的使用來區(qū)分碳青霉烯酶的表型,可用于流行病學研究或感染控制。CarbAcinetoNP檢測方法是依據(jù)CarbaNP檢測方法稍作改變而來，能夠更好的檢測不動桿菌屬中的碳青霉烯酶。這兩種檢測方法特異性及敏感性很高，而且檢測時間短，費用低，普通的實驗員就能操作，不需要任何儀器，可以在一般的實驗室就能完成。2015年CarbaNP試驗被引入了CLSI藥敏試驗標準，做為碳青霉烯酶表型的篩選試驗。紫外分光光度法也可以用來檢測碳青霉烯酶。PCR試驗可以檢測已知碳青霉烯酶的類型，測序則可以發(fā)現(xiàn)新的碳青霉烯酶的突變基因。我們可以很好的利用這些檢測方法服務于廣大病患，快速的檢測出碳青霉烯酶存在的菌株，采取有力的預防措施，阻止他們的播散。

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山東省自然科學基金資助項目(ZR2014HL090)

1007-4287(2016)08-1415-04

2015-08-25)