來岳標汪玉琪姚慶華

·論著·

川芎嗪對乳腺癌MCF7細胞凋亡的影響及機制研究

來岳標1汪玉琪1姚慶華2

目的 觀察川芎嗪（TMP）對乳腺癌MCF7細胞株凋亡的影響及其可能的機制。方法建立乳腺癌MCF7細胞體外培養(yǎng)體系。MTT法檢測不同濃度TMP對乳腺癌MCF7細胞增殖的影響，流式細胞儀、電子顯微鏡和免疫印跡法分別檢測各組細胞凋亡比例，觀察細胞凋亡特征，檢測MAPK信號通路相關(guān)基因如ERK、p38和JNK表達水平。結(jié)果予0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mg/mL TMP處理48h后，MCF7細胞抑制率分別為（2.95±2.45）%、（18.62±4.60）%、（31.15±3.58）%、（47.13± 4.15）%和（62.14±5.23）%；0、0.50、1.00、1.50、2.00mg/mL的TMP處理48h， MCF7細胞凋亡率分別為1.58%、3.29%、13.21%、19.23%、29.38%，形態(tài)學觀察顯示典型的凋亡特征。TMP處理后細胞中p-p38和p-JNK蛋白表達以劑量依賴的方式增加，而p-ERK以劑量依賴的方式減少。結(jié)論 TMP能誘導乳腺癌MCF7細胞凋亡，其機制可能與激活MAPK信號通路有關(guān)。

乳腺癌；MCF7；凋亡；川芎嗪；MAPK

與其他大多數(shù)國家一樣，乳腺癌已成為中國女性最常見的癌癥。中國乳腺癌每年新發(fā)數(shù)量和死亡數(shù)量分別占全世界的12.2%和9.6%[1]。TMP是從中藥川芎中提取的生物堿，它具有多種生物學活性。臨床上常用于治療腦血管疾病及腎臟病等[2]。近年來，多項研究證明，TMP可以應用于抗腫瘤的治療[3-5]。但是TMP發(fā)揮其抗腫瘤作用的分子機制尚不完全清楚。以往的研究[6]表明，TMP可以誘導腫瘤細胞凋亡。在生理和病理條件下，細胞凋亡是一種代謝的過程，具有特定的形態(tài)特征，包括細胞皺縮，染色質(zhì)濃縮，凋亡小體的形成[7-8]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導通路是由不同的細胞外刺激激活，導致廣泛的細胞反應，包括細胞凋亡、增殖和炎癥。已經(jīng)確定細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、p38和應激活化蛋白激酶（SAPK）/c－Jun（JNK）是三個主要的MAPK途徑[9－11]。然而，TMP對于MCF7細胞分子水平的作用仍然知道的很少。本實驗通過流式細胞儀、電子顯微鏡和免疫印跡法檢測TMP作用后乳腺癌MCF7細胞凋亡水平以及MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響，探討TMP體外誘導MCF7細胞凋亡的作用及其分子機制，為TMP的進一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞與細胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF7細胞株由浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院實驗室提供。細胞在37℃、5%CO2含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞生長至80%融合時進行傳代，用0．25%胰酶常規(guī)消化，1:3～1:5比率進行傳代。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2 藥 物 注射用鹽酸川芎嗪（商品名：瑞科林，北京四環(huán)科寶制藥有限公司，規(guī)格：80mg/支）。

1.3 試劑及儀器 抗體包括Action，ERK，p38，JNK，P－ERK，P－P38，P－JNK，均從Sigma購買（圣路易斯，美國）。U0126（ERK抑制劑），SB203580（p38抑制劑）及SP600125（JNK抑制劑）從Sigma購買（圣路易斯，美國）。BCA蛋白濃度測定試劑盒從碧云天公司購買（上海，中國）。透射電鏡由浙江大學提供（浙江，中國），流式細胞儀及本研究所需的其余儀器設備由浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院提供（浙江，中國）。

1.4 實驗方法

1.4.1 MTT法檢測TMP對乳腺癌MCF7細胞增殖作用 取對數(shù)生長期的MCF7細胞，細胞濃度調(diào)整至4×104個/mL，然后將上述細胞懸液加入96孔板，每孔200μL。當細胞貼壁后，各實驗組分別加入含0．25、0．50、1．00、1．50、2．00mg/mL的 TMP空白血清DMEM 200μL。每個藥物濃度設置五個平行孔。在作用24、48、72h后分別加入20μL的MTT液，然后再培養(yǎng)4h后仔細吸除上清；每孔均勻加入150μL二甲基亞砜。用多模式微孔板閱讀機器測定吸光度（A），檢測參考波長為570、630nm，計算細胞生長抑制率，實驗重復3次。

1.4.2 PI單染色流式細胞儀檢測TMP對乳腺癌MCF7細胞周期的作用 MCF7細胞接種于培養(yǎng)瓶中，分對照組及0．50mg/mL、1．00mg/mL、1．50mg/mL、2．00mg/mL濃度TMP干預組。藥物作用48h后用0．25%的胰酶消化，收集細胞。制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2×106/mL。取1mL細胞，1000rpm 4℃離心10min，棄上清液。各管中加入195μL Annexin－Ⅴ－FITC結(jié)合緩沖液，輕輕重懸細胞。加入5μL Annexin－Ⅴ－FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育 10min。1000rpm離心5min，棄上清。各流式管中加入195μL結(jié)合緩沖液，輕輕重懸細胞。加入5μLPI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置10min。流式細胞儀上測定，數(shù)據(jù)由計算機處理并打印。實驗重復3次。

1.4.3 細胞形態(tài)觀察 MCF7細胞接種于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)24h后小心吸棄培養(yǎng)上清液。實驗分為對照組和TMP干預組，其中TMP干預組加入含1．00mg/mL TMP血清培養(yǎng)液3mL，而對照組僅加等量的空白血清培養(yǎng)液，各自培養(yǎng)48h后小心吸棄培養(yǎng)上清液。取對照組及1．00mg/mL TMP干預滿48h的MCF7細胞，用0．25%的胰酶消化，離心收集細胞。用2．5%的戊二醛固定2h，1%鋨酸再固定30min，乙醇一丙酮梯度脫水，包埋，常規(guī)超薄切片，透射電鏡下觀察。

1.4.4 免疫蛋白印跡分析 不同濃度TMP處理的MCF7細胞樣品在RIPA裂解緩沖液勻漿。蛋白濃度用BCA法檢測。印跡膜封閉于5%牛血清白蛋白，隨后分別暴露于特定的一抗：ERK（1:2000），p38（1: 2000），JNK（1:2000），p－ERK（1:2000），p－p38（1: 2000），p－JNK（1:2000）。用HRP標記的第二抗體孵育后，電化學發(fā)光試劑處理膜，然后暴露于放射自顯影儀中進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 TMP對MCF7細胞增殖的抑制作用 不同濃度的TMP作用MCF7細胞24～72h后，MTT比色法測得的各組細胞抑制率顯示示，TMP能明顯抑制MCF7細胞的增殖，TMP 0．25、0．50、1．00、1．50、2．00mg/mL處理48h，對MCF7細胞生長的抑制率分別為（2．95± 2．45）%、（18．62±4．60）%、（31．15±3．58）%、（47．13± 4．15）%和（62．14±5．23）%，作用呈劑量和時間依賴性。見圖1（202頁）。

2.2 細胞流式實驗檢測TMP對MCF的凋亡作用 0、0．50、1．00、1．50、2．00mg/mL TMP處理細胞48h后，AV+/PI－的數(shù)量（細胞凋亡）分別為1．58%、3．29%、13．21%、19．23%、29．38%，呈現(xiàn)出濃度依賴性，各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。結(jié)果表明，TMP可誘導MCF7細胞凋亡。見圖2（202頁）。

2.3 TMP作用前后MCF7細胞形態(tài)學的改變 正常情況下MCF7細胞在倒置顯微鏡下觀察生長良好，形狀不規(guī)則，呈梭形或多角形，并可融合形成集落，生長有巢狀現(xiàn)象，細胞核大，核異型，核質(zhì)比高，可見異常核分裂相。TMP作用前后透射電鏡，結(jié)果顯示，對照組MCF7細胞形態(tài)飽滿，細胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，細胞器清晰,見圖3A（封三）。1．0mg/mL TMP作用48h后，MCF7細胞發(fā)生了凋亡細胞形態(tài)學特征性變化，細胞體積縮小，細胞核固縮，核染色質(zhì)密集，胞漿濃縮，胞質(zhì)內(nèi)充滿大小不等的空泡，見圖3B（封三）。

2.4 MAPK信號通路在TMP誘導細胞凋亡中的作用 為探討MAPK信號通路是否參與了TMP誘導的細胞凋亡，檢測MAPK信號通路的磷酸化水平。1、2mg/mL的TMP處理細胞48h后，用Western blot檢測ERK、p38和JNK的表達。TMP處理MCF7細胞后磷酸化ERK的表達量持續(xù)降低，磷酸化p38和磷酸化JNK表達增加；而JNK和p38和ERK的總量變化不大，見圖4（封三）。這些結(jié)果表明，TMP減少了ERK的活化，促進p38、JNK的活化，而這些變化是與細胞凋亡密切相關(guān)的。為確定是否這些激酶可誘導細胞凋亡，影響細胞MAPK的活化，用MAPK通路抑制劑U0126、SB203580和SP600125分別處理MCF7細胞1h后加入1mg/mL TMP處理48h。我們發(fā)現(xiàn)，ERK抑制劑U0126處理1h后ERK的磷酸化水平增加明顯，而p38抑制劑SB203580處理細胞1h后p38的磷酸化水平降低。同樣，JNK的磷酸化也在細胞運用SP600125處理后降低，見圖5（202頁）。

3 討 論

細胞凋亡是一種基因編碼的導致細胞開啟自殺程序的結(jié)果，具有形態(tài)和生化變化，可見染色質(zhì)邊集，核碎片的產(chǎn)生。本研究中，TMP誘導乳腺癌MCF7細胞凋亡呈劑量和時間依賴性，已由流式檢測中PI 和Annexin V的變化說明。實驗中通過電子顯微鏡觀察到細胞凋亡的形態(tài)學變化，直接證明MCF7細胞的凋亡。與未經(jīng)處理的細胞相比，1mg/mL的TMP處理后細胞微絨毛消失，細胞收縮，核碎片含有的染色質(zhì)濃縮和膜泡，細胞質(zhì)邊集，呈典型的凋亡細胞形態(tài)的變化。

MAPK信號通路在多種細胞外信號刺激細胞表面激活細胞核內(nèi)的基因并作出相應的響應過程中發(fā)揮著重要的作用。通常是由有絲分裂原刺激的ERK參與細胞的增殖、分化和增殖活性。JNK和p38激酶主要由細胞外刺激產(chǎn)生應答。這些激酶的激活導致細胞的反應取決于細胞類型的變量。一些研究表明，雙重作用的細胞反應中的MAPK似乎是特定類型的細胞凋亡[12－14]。MAPK活性在細胞凋亡中的確切作用仍有待進一步研究[15－19]。該研究發(fā)現(xiàn)，TMP處理24h后，磷酸化JNK和磷酸化p38含量有明顯的劑量依賴性增加，但磷酸化ERK有一個明顯的降低，且呈劑量依賴性。研究結(jié)果表明，TMP處理后的p38、JNK 和ERK均有明顯的變化，而MAPK通路川芎嗪誘導MCF7細胞的凋亡中扮演著重要的角色。

綜上所述，本研究表明TMP處理后能引起乳腺癌MCF7細胞凋亡，同時TMP可以使p38、JNK活化，表明MAPK通路在TMP誘導的MCF7細胞的凋亡中發(fā)揮重要作用。

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（收稿：2015-07-08 修回：2015-09-28）

Effectof Tetramethypyrazine on Breast Cancer MCF7 CellApoptosis and The Underlying Mechanism

LAIYuebiao1,WANG Yuqi1,YAO Qinghua2.1 The First Clinical Medical College,Zhejiang Traditional Chinese Medical University,Hangzhou（310053）,China;2 Department of Integrated Chinese and Western Medicine,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou（310022）,China

ObjectiveTo study the effectof tetramethypyrazine on breast cancer MCF7 Cellapoptosis and the underlying mechanism.MethodsHuman breast cancer MCF7 cellscultured in vitrowere used to detect the inhibition rate of tetramethypyrazine in different concentrations（0.25,0.50,1.00,1.50,2.00mg/ml）by MTT assay.The flow cytometry,electron microscope and western blot method were used to detect the apoptosis ratioofdifferent groups;the apoptosis characteristics were observed;andthe level of MAPK signal pathway related genes ERK, p38and JNK,were determined.ResultsAfter treatment with tetramethypyrazine for 48h,the inhibition rate of human breast cancer MCF7 cells in 0.25,0.50,1.00,1.50,2.00mg/ml groups were（2.95±2.45）%,（18.62±4.60）%, （31.15±3.58）%,（47.13±4.15）%,and（62.14±5.23）%,respectively;the apoptosis ratio of MCF7 cells were1.58%, 3.29%,13.21%,19.23%,and 29.38%.Morphological observation showed typical apoptosis characteristics of MCF7 cells after tetramethypyrazine treatment.The protein expression of p-p38and p-JNK increased in a dose-dependent manner,but p-ERK reduced.ConclusionTetramethypyrazinecan induce the apoptosis of breast cancer MCF7 cells,and its mechanism may be related to activation of MAPK signal pathway.

apoptosis;MCF7;apoptosis;tetramethypyrazine;MAPK

1浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院（杭州 310053）；2浙江省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科（杭州 310022）

姚慶華，TEL：13588899111；E-mail：danfer1001@163.com