王亞平，格日力

(1.青海省人民醫(yī)院消化科；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心)

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不同海拔及時(shí)間下大鼠白細(xì)胞TERT及HIF-1α mRNA的表達(dá)及其對(duì)機(jī)體細(xì)胞壽命的影響和可能機(jī)制※

王亞平1，2，格日力2

(1.青海省人民醫(yī)院消化科；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心)

摘要目的研究不同海拔及時(shí)間下大鼠白細(xì)胞TERT及HIF-1α mRNA的表達(dá)規(guī)律，并探討其對(duì)機(jī)體細(xì)胞壽命的影響及其可能機(jī)制。方法110只大鼠隨機(jī)分為低海拔對(duì)照組、中度海拔組及特高海拔組，后兩組根據(jù)時(shí)間不同分為1、3、7、15、30天組，每組各10只。采用real-time PCR法檢測(cè)大鼠白細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)及低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)mRNA表達(dá)水平，并行相關(guān)意義分析。結(jié)果中度海拔組大鼠白細(xì)胞TERT mRNA水平明顯高于低海拔與特高海拔組(P<0.05)，各組TERT mRNA水平變化與時(shí)間相關(guān)；HIF-1α mRNA在中度海拔與特高海拔組表達(dá)均升高，中度海拔組又高于特高海拔組(P<0.05)，其變化趨勢(shì)與TERT水平的變化基本一致。結(jié)論輕度低氧可通過(guò)HIF-1α上調(diào)TERT的表達(dá)，從而使白細(xì)胞端粒酶活性升高、端粒長(zhǎng)度延長(zhǎng)、機(jī)體細(xì)胞壽命增加。

關(guān)鍵詞海拔時(shí)間端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶低氧誘導(dǎo)因子1α

EXPRESSIONS OF TERT AND HIF-1α mRNA IN RAT

LEUKOCYTES UNDER DIFFERENT ALTITUDES AND

DIFFERENT PERIODS OF TIME AS WELL AS THE INFLUENCE

AND POSSIBLE MECHANISM ON THE LIFE SPAN OF CELLS

Wang Yaping1，2，Ge Rili2

(1.Digestive Department of Qinghai Provincial People′s Hospital，Xining，810007；

2.Research Center for High Altitude Medical Sciences，Medical College of Qinghai University，Xining，810001)

Abstract ObjectiveTo investigates the changes of TERT and HIF-1α mRNA in rat leukocytes under different altitudes and different periods of time，discusses the influence and possible mechanism on the life span of body cells.Methods 110 rats were randomly divided into three groups，low altitude group，moderate altitude group and very high altitude group.The later two groups were further divided into 1，3，7，15 and 30 days groups，with 10 rats in each group.TERT and HIF-1α mRNA levels of leukocytes were measured using real-time PCR，and analyzed the related significance.Results The TERT mRNA expression of leukocytes in moderate altitude group was significantly higher than control group and very high altitude group(P<0.05)，and the changes of TERT mRNA expression are associated with time.The HIF-1α mRNA expression in moderate altitude group and very high altitude group were higher than that of control group(P<0.05)，however，the HIF-1α expression was much higher in the moderate altitude group than in the very high altitude group.HIF-1α mRNA expression changed in a similar manner as the TERT mRNA.Conclusions The TERT expression was up-regulated following the induction of HIF-1α during exposure to mild hypoxia，it makes the increasing of activity for leukocytes telomerase and the elongatin of telomere length，the life span on cells was extended.

KeywordsAltitudesTimeTelomerase reverse transcriptaseHypoxia-inducible factor 1α

高原環(huán)境有諸多不利因素作用于人體，其中低氧是影響和損傷機(jī)體的關(guān)鍵。目前關(guān)于低氧對(duì)細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)、端粒酶(telomerase)及端粒(telomere)影響的研究報(bào)道逐漸增多，但其主要集中在對(duì)離體干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的短期研究，缺乏不同低氧水平及時(shí)間下在體體細(xì)胞的系統(tǒng)觀察比較[1-3]。因此本研究從整體水平上觀察不同海拔及不同時(shí)間下大鼠白細(xì)胞TERT及低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)mRNA的表達(dá)水平及變化規(guī)律，并探討其對(duì)機(jī)體細(xì)胞壽命的影響及其可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物處理

110只健康雄性Wistar 大鼠[(180±20)g，購(gòu)自中國(guó)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇)2009-009]隨機(jī)分為 3 組：低海拔對(duì)照組 10只(LA，南京，10m)，中度海拔組50只(MA，西寧，2260m)，特高海拔組 50只(VHA，低壓氧艙模擬，5000m)，后兩組根據(jù)暴露時(shí)間不同分為1、3、7、15、30天組，每組各10只。三組除所處海拔高度不同外，其居住及飲食環(huán)境基本一致，所有大鼠均自由進(jìn)食(水)。按不同海拔不同時(shí)間點(diǎn)分別抽取各組大鼠靜脈血(5mL)，其中低海拔組在南京即刻取血，中度海拔組在西寧按不同時(shí)間點(diǎn)取血，特高海拔組大鼠在低壓氧艙(模擬海拔 5000m)按不同時(shí)間點(diǎn)取血。

1.2儀器和試劑選擇

低壓氧艙室(貴州風(fēng)雷航空機(jī)械有限公司，型號(hào)：DYC-3000，體積：8m×3m×3m)，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司)，ABI7500熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，TRIzol RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)，Script RT Kit(北京天根生物制劑有限公司)，2×SYBR Premix Ex Taq(美國(guó)ABI公司)。

1.3引物設(shè)計(jì)

引物終濃度及序列：目的基因，TERT rat-f(400nmol)：5′-GAC ATG GAG AAC AAG CTG TTT GC-3′，TERT rat-r(400 nmol)：5′-ACA GGG AAG TTC ACC ACT GTC-3′；HIF-1a rat-f(400nmol)：5′-CTA TGA CGT GCT TGG TGC TGA T-3′，HIF-1a rat-r(400nmol)：5′-CTG TAC TGT CCT GTG GTG ACT T-3′。內(nèi)參基因：18S rat-f(400nmol)：5′-AGT GAT CCC CGA GAA GTT T-3′，18S rat-r(400nmol)：5′-GCT TTC CTC AAC ACC ACA T-3′。

1.4靜脈血紅蛋白(HGB)測(cè)定

使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定靜脈血HGB，采集并分析數(shù)據(jù)。

1.5RNA的提取及鑒定

使用TRIzol RNA提取試劑盒提取大鼠靜脈血白細(xì)胞基因組總RNA，測(cè)定其濃度及質(zhì)量，取2 μg A260/A280為1.9-2.0的總RNA為逆轉(zhuǎn)錄模板，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，用于real-time PCR實(shí)驗(yàn)。

1.6TERT及HIF-1α mRNA測(cè)定

采用real-time PCR法測(cè)定大鼠白細(xì)胞TERT及HIF-1α mRNA水平：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品cDNA原濃度為起始濃度依次稀釋?zhuān)♂屢蜃訛?2，共稀釋5個(gè)濃度；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)化反應(yīng)體系，使目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率一致；PCR 反應(yīng)體系(20μL體系)為：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，第一鏈cDNA 1 μL，目的基因TERT、HIF-1α及內(nèi)參基因 18S rRNA上、下游引物各 1 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至 20 μL。實(shí)驗(yàn)在 ABI7500 熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 儀中進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每組樣品重復(fù)1 次。目的基因與內(nèi)參基因的 PCR 反應(yīng)條件一致，50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算TERT及HIF-1α mRNA的表達(dá)水平，即ΔCt = CtTERT/HIF-1α- Ct18S；2-ΔΔCt=2-(ΔCt1-ΔCt2)，其中ΔCtl與ΔCt2分別為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組樣本的ΔCt值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1各組大鼠靜脈HGB水平比較(表1)

Table 1±s)

注：*與LA組比較P<0.05；☆與VHA3組比較P<0.05；▲與VHA7組比較P<0.05；★與VHA15比較P<0.05；#與MA3組比較P<0.05；△與VHA3組比較P<0.05?！跖cMA組同時(shí)間段比較P<0.05.

表1顯示，特高海拔組大鼠靜脈HGB隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，其明顯高于低海拔組與中度海拔組(P<0.05)，說(shuō)明通過(guò)模擬低壓氧艙成功建造了特高海拔組大鼠模型。

2.2各組大鼠白細(xì)胞TERT mRNA水平比較(表1)

表1顯示，中度海拔組大鼠白細(xì)胞TERT mRNA表達(dá)水平明顯高于低海拔組與特高海拔組(P<0.05)。TERT mRNA水平的變化與時(shí)間相關(guān)，中度海拔組在第1天明顯升高，隨后下降并保持穩(wěn)定，但仍高于其他兩組水平，特高海拔組在第1天出現(xiàn)短暫升高，隨后降為與低海拔組一致的水平并保持穩(wěn)定。

2.3各組大鼠白細(xì)胞HIF-1α mRNA水平比較(表1)

表1顯示，HIF-1α mRNA表達(dá)水平在中度海拔與特高海拔組均明顯升高(P<0.05)，中度海拔組又高于特高海拔組(P<0.05)，各組白細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與TERT mRNA表達(dá)水平的變化基本一致。

3討論

已知在正常細(xì)胞中表達(dá)TERT能夠重建端粒酶活性，延長(zhǎng)染色體末端的端粒長(zhǎng)度，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，增加細(xì)胞壽命[4]。已有的研究也表明TERT可維持端粒長(zhǎng)度，阻止凋亡發(fā)生，從而使細(xì)胞保持年輕狀態(tài)及永生化[5]，而抑制TERT可使細(xì)胞喪失端粒酶活性，發(fā)生衰老凋亡[6]。HIF-1α在低氧誘導(dǎo)的相關(guān)基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，低氧環(huán)境下HIF-1α表達(dá)增高可激活其下游靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而調(diào)動(dòng)機(jī)體的低氧適應(yīng)機(jī)制，使機(jī)體耐受低氧[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞在正常情況下維持較低水平的端粒酶活性，當(dāng)進(jìn)入低氧環(huán)境時(shí)，HIF-1α表達(dá)增高可上調(diào) TERT 的表達(dá)，從而增強(qiáng)端粒酶活性、延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度[9]。本研究顯示中度海拔組大鼠白細(xì)胞 HIF-1α及TERT mRNA的表達(dá)明顯升高，提示輕度低氧可誘導(dǎo)HIF-1α上調(diào)TERT表達(dá)。

氧化應(yīng)激是損傷細(xì)胞端粒和抑制端粒酶活性的主要原因之一。當(dāng)暴露于嚴(yán)重低氧環(huán)境時(shí)，機(jī)體可產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，ROS通過(guò)間接下調(diào)TERT的表達(dá)及端粒酶活性，使端粒縮短加快[10-11]。本研究顯示特高海拔組大鼠白細(xì)胞HIF-1α mRNA的表達(dá)水平盡管高于低海拔對(duì)照組，但卻低于中度海拔組，其主要是由于嚴(yán)重低氧環(huán)境下機(jī)體產(chǎn)生的大量ROS可部分抑制HIF-1α的高表達(dá)，使一些對(duì)細(xì)胞低氧敏感基因的適應(yīng)性反應(yīng)遭到損害[12]，細(xì)胞TERT表達(dá)隨之下降，疊加ROS即氧化應(yīng)激對(duì)TERT表達(dá)及端粒酶活性的直接抑制作用，抵消了低氧狀態(tài)下HIF-1α對(duì)TERT、端粒酶活性的上調(diào)作用，最終使特高海拔組大鼠白細(xì)胞TERT表達(dá)無(wú)明顯變化。同時(shí)暴露于低氧環(huán)境后，HIF-1α、TERT的表達(dá)呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)，即第一天明顯升高，隨后下降并保持穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，急性低氧可誘導(dǎo)機(jī)體HIF-1α高表達(dá)，而慢性低氧可下調(diào)HIF-1α的基因及蛋白表達(dá)，從而使TERT隨之發(fā)生相應(yīng)的表達(dá)變化。

本研究結(jié)果表明，輕度低氧通過(guò)HIF-1α上調(diào)TERT的表達(dá)，可使白細(xì)胞端粒酶活性升高，端粒長(zhǎng)度延長(zhǎng)，機(jī)體細(xì)胞壽命增加。本研究系統(tǒng)地觀察了不同低氧水平和低氧時(shí)間下大鼠白細(xì)胞TERT及HIF-1α mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境下，TERT 的表達(dá)是隨HIF-1α的表達(dá)水平而變化的，二者的變化趨勢(shì)基本一致，且其表達(dá)水平變化與低氧暴露時(shí)間密切相關(guān)。但這一發(fā)現(xiàn)仍存在一些不足及局限性：一是本研究只是對(duì)大鼠的研究分析，與人體之間存在一定的差異；二是本研究為短期研究，缺乏長(zhǎng)期的觀察比較，故由大鼠所得出的結(jié)論并不一定能代表不同低氧水平及時(shí)間對(duì)人體白細(xì)胞TERT、端粒酶活性及端粒長(zhǎng)度的影響。針對(duì)以上不足及局限性，下一步的主要研究方向：首先對(duì)合適的人群進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的分析研究，其次分別從短期和長(zhǎng)期兩個(gè)方面進(jìn)行觀察比較，進(jìn)一步深入研究低氧對(duì)人體細(xì)胞TERT、端粒酶、端粒及其壽命的影響。

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收稿日期2015-02-03

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.04.001

中圖分類(lèi)號(hào)R363.16

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

※：國(guó)家自然科學(xué)基金(31160219)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(973)(2012CB518200)；國(guó)家國(guó)際合作項(xiàng)目(2011DFA32720)

王亞平(1982~)，女，漢族，甘肅籍，博士，主治醫(yī)師