黃林芳，肖欣悅，張　烜

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

背景及研究進(jìn)展

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種致殘率較高的自身免疫性疾病，全球患者超過5 000萬(wàn)，它以滑膜炎為病理基礎(chǔ)，目前與其發(fā)病相關(guān)的基因被不斷發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，如HLA-DRB1、TNFAIP3、PTPN22和PADI4等，更發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素也參與了其發(fā)病[1- 4]，一項(xiàng)針對(duì)雙胞胎RA的研究表明，基因遺傳在其發(fā)病中所發(fā)揮的作用僅占60%[5]，個(gè)體需具備RA遺傳背景、環(huán)境等綜合因素，才能最終導(dǎo)致RA的發(fā)生[6]，近期越來越多的研究顯示，環(huán)境因素中的微生物菌群被認(rèn)為與RA發(fā)病密切相關(guān)。國(guó)際學(xué)術(shù)界也發(fā)現(xiàn)了腸道菌群和眾多疾病密切相關(guān)[7]，包括消化道疾病(如腸炎[8])、代謝類疾病(如2型糖尿病[9])、傳染性疾病(如肝硬化[10])，還有心腦血管疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化[11])和免疫性疾病，個(gè)體想要維持健康狀態(tài)，須在兼容有益微生物群的同時(shí)識(shí)別及對(duì)抗入侵物[12]?？梢哉f，腸道菌群研究給諸多疾病的研究提供了一個(gè)非常好的切入點(diǎn)，然而目前對(duì)有關(guān)參與RA發(fā)病機(jī)制的微生物的研究還不夠深入，從而阻礙了對(duì)RA更具有效性及特異性的治療方法的探索。因此，全面了解RA相關(guān)的微生物菌群有助推動(dòng)對(duì)RA病理生理的深入探索及早期診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)現(xiàn)。

隨著大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，組學(xué)方法使我們更好地理解人類微生物組的組成和功能[13]。幾十年來，科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)可培養(yǎng)的人體腸道內(nèi)細(xì)菌種類為1 000～1 150種，而每個(gè)個(gè)體至少有160種細(xì)菌，表明細(xì)菌在個(gè)體中是具有多樣性的，這或許與適應(yīng)環(huán)境改變和受到宿主基因遺傳性的影響有關(guān)[14]，研究發(fā)現(xiàn)，在任何時(shí)間，個(gè)體攜帶含有大約300萬(wàn)個(gè)蛋白編碼基因的1～3 kg細(xì)菌[15]，同時(shí)，居住在不同生物領(lǐng)域獨(dú)特的微生物菌團(tuán)，也只能在特定的營(yíng)養(yǎng)條件下生存[16]。人體的腸道微生物(通過1 000多個(gè)不同的物種代表)以一個(gè)成熟并對(duì)個(gè)體有益的方式進(jìn)化著，并且提供酶來幫助我們從飲食中提取所需的基本維生素和氨基酸，在這一進(jìn)化過程中逐漸形成了腸道微生物和宿主免疫反應(yīng)之間的相互適應(yīng)性。良好的腸道微生物群形成的免疫系統(tǒng)，能維持體內(nèi)的平衡健康狀態(tài)，菌群紊亂時(shí)則可導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[17]，包括肥胖、糖尿病、胃腸道癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化等，其中在自身免疫病領(lǐng)域最先報(bào)道的是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)[8]，其生態(tài)失調(diào)的過程以腸道有益微生物群種類的減少及腸道菌總量的增加為特征。

微生物在疾病發(fā)病過程中的潛在決定作用一直未被重視，隨著現(xiàn)代微生物學(xué)的發(fā)展，微生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步推動(dòng)了微生物群的許多研究。17世紀(jì)，荷蘭顯微鏡學(xué)家列文虎克通過對(duì)自己牙菌斑的研究，開拓了微生物學(xué)的研究道路。紐約大學(xué)免疫學(xué)家Dan Littman的研究也發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)菌對(duì)于Th17細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要，正常無菌條件下飼養(yǎng)的小鼠生成的Th17細(xì)胞極少，但在實(shí)驗(yàn)過程中，他的研究小組發(fā)現(xiàn)購(gòu)自一個(gè)供應(yīng)商的小鼠相比于來自另一個(gè)不同供應(yīng)商的小鼠具有更多的Th17細(xì)胞，結(jié)果表明，這一差異是由于小鼠的腸道微生物不同所導(dǎo)致的[18-19]。

腸道微生物是一個(gè)影響新陳代謝及免疫穩(wěn)態(tài)的環(huán)境因素，每個(gè)個(gè)體腸道微生物的組成是相對(duì)穩(wěn)定的[20-21]，但個(gè)體之間差異卻很大[22]，它們覆蓋在腸道上皮細(xì)胞，維持著機(jī)體的正常免疫、清除致病性微生物等功能。隨著時(shí)間的推移，越來越多的研究開始關(guān)注疾病與特定的細(xì)菌和病毒的發(fā)病關(guān)系，包括RA、IBD、脊柱關(guān)節(jié)病(強(qiáng)直性脊柱炎和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎)。微生物在自身免疫和其他風(fēng)濕性疾病的作用已慢慢滲入我們的研究中，現(xiàn)代微生物學(xué)的報(bào)道進(jìn)一步證實(shí)了腸道細(xì)菌感染可以引起關(guān)節(jié)炎這一假說，因此，人們也試圖通過改變腸道細(xì)菌成分來治療炎癥性關(guān)節(jié)炎。一個(gè)典型的例子是柳氮磺胺吡啶，這一藥物最終被視為改善病情的抗風(fēng)濕藥(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)，并被美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于治療RA和IBD，其他一些具有抗菌特性的藥物也被用于RA的治療。RA與菌群相關(guān)的研究逐漸開始被報(bào)道，研究證明初診RA患者普氏菌增加而有益微生物減少，而普氏菌屬的相對(duì)含量與表位共享基因的存在呈負(fù)相關(guān)，這表明人類腸道微生物的組成也可以部分地依賴于宿主基因組[23]。同類宏基因組之間也存在顯著差異，雖然這尚未得到充分的研究，但這些變化可能與治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)存在某些相關(guān)性，二氫葉酸還原酶水平豐富的宏基因組樣本擬桿菌，可能與宿主二氫葉酸還原酶競(jìng)爭(zhēng)甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)的結(jié)合和新陳代謝，因此RA患者微生物區(qū)高二氫葉酸還原酶含量的增加可能有助于解釋為什么只有部分RA患者口服MTX有效。

綜上所述，這些研究提示腸道微生物在RA發(fā)病機(jī)制中存在很大的作用。針對(duì)腸道細(xì)菌的治療在最近幾十年已被納入治療風(fēng)濕病戰(zhàn)略的一部分，許多組織正在試圖通過調(diào)節(jié)菌群的組成成分以減輕炎癥反應(yīng)，目前正在使用從生態(tài)系統(tǒng)水平干預(yù)到針對(duì)單一靶目標(biāo)的方法，采用親密捐贈(zèng)者的完整細(xì)菌菌落，試圖用糞便微生物移植來恢復(fù)受者的“健康”腸道微生物[24]。糞便微生物移植在抗感染性結(jié)腸炎梭狀芽胞桿菌已被證明是非常有效的，盡管取得了引人注目的結(jié)果，但這種技術(shù)的使用尚存在一系列挑戰(zhàn)性，包括如何定義一個(gè)健康的微生物組、如何考慮一個(gè)合適的捐贈(zèng)者等[25]。目前關(guān)于RA與腸道菌群的研究尚處于初始階段。

重大研究結(jié)果

人類腸道微生物在自身免疫性疾病中的作用越來越被認(rèn)可，對(duì)其認(rèn)識(shí)的加深可能改變我們現(xiàn)在認(rèn)為的生理和疾病狀態(tài)。越來越多的研究表明，為了充分利用微生物的功能，人類通過保持低度的炎癥狀態(tài)來維持與腸道菌群的共生關(guān)系，然而，某些對(duì)共生微生物群相對(duì)組成的干擾可以改變腸道固有層內(nèi)的免疫穩(wěn)態(tài)，引起異常的免疫反應(yīng)，隨著越來越多的人類微生物組研究的應(yīng)用，許多問題亟需更進(jìn)一步的探索。

國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)通過元基因組關(guān)聯(lián)分析法，揭示了口腔和腸道微生物菌群或與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的致病和保護(hù)機(jī)制相關(guān)[26]。

研究通過收集未經(jīng)治療及少數(shù)經(jīng)DMARDs治療的RA患者的糞便、牙菌斑和唾液樣本，以健康人群(包括直系親屬和共同生活無血緣關(guān)系親屬)作為對(duì)照進(jìn)行對(duì)比研究，并對(duì)治療前后RA患者的口腔和腸道微生物菌群的變化進(jìn)行對(duì)比研究，運(yùn)用元基因組鳥槍法測(cè)序技術(shù)檢測(cè)微生物組DNA[27]。研究共檢測(cè)了212份糞便標(biāo)本：77例初治RA患者、80例健康對(duì)照、17例初治RA及與其相應(yīng)的17例健康親屬、21例DMARDs治療過的RA患者，通過整合數(shù)據(jù)入已有的腸道微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)目錄[28]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)77例初治RA患者和80例健康對(duì)照腸道微生物的組成都具有多樣性的特征，為了進(jìn)一步明確RA相關(guān)腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的差異性，我們辨認(rèn)了117 219個(gè)高表達(dá)于RA患者的基因標(biāo)記，并且根據(jù)其變異豐度將這些基因整合入宏基因組關(guān)聯(lián)組群(MLGs)[29]，形成了至少包含100個(gè)基因的88個(gè)MLGs，其中包括RA患者高表達(dá)的MLGs、對(duì)照組高表達(dá)的MLGs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RA腸道高表達(dá)革蘭陽(yáng)性菌、低表達(dá)革蘭陰性菌，同時(shí)脂多糖的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌能力也低于健康對(duì)照，而還原性乙酰輔酶A通路的產(chǎn)生乙酸鹽的細(xì)菌(如某些梭菌屬)的表達(dá)是增加的，這些結(jié)果表明RA患者腸道微生物群不同于健康對(duì)照。

為進(jìn)一步分析口腔微生物是否也與RA相關(guān)，該研究通過運(yùn)用鳥槍法測(cè)序檢測(cè)了105個(gè)牙菌斑標(biāo)本：54例初治RA患者、51例健康對(duì)照；98例唾液標(biāo)本：51例初治RA患者、47例健康對(duì)照，然后將這些序列重新整合入一個(gè)包含320萬(wàn)基因的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，通過牙菌斑和唾液標(biāo)本，分別辨認(rèn)了371 990和258 055個(gè)基因標(biāo)記，采取同樣的方法構(gòu)建了MLGs，就目前所知，這是口腔腸道菌群的第一個(gè)宏基因組關(guān)聯(lián)分析，同樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RA患者口腔微生物群也是失調(diào)的。統(tǒng)一得出以下結(jié)論：與健康人群相比，RA患者的口腔與腸道菌群在氧化還原條件下，鐵、硫、鋅和精氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝以及RA相關(guān)抗原如瓜氨酸環(huán)化的分子擬態(tài)等方面均表現(xiàn)出明顯異常，RA患者可檢測(cè)到失調(diào)的腸道微生物群，包括升高的革蘭陽(yáng)性菌和降低的革蘭陰性菌等，并且與其臨床癥狀具有相關(guān)性，如自身免疫病相關(guān)抗體滴度，同時(shí)口腔微生物群也是失調(diào)的。

RA患者身體不同部位微生物菌群是否具有一致性或差異性的特點(diǎn)？研究者通過全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG數(shù)據(jù)庫(kù))功能模塊分析，發(fā)現(xiàn)腸道和口腔微生物菌群功能具有一致性特點(diǎn)，存在于口腔、腸道中的某種嗜血桿菌(Haemophilussp)在RA患者中呈現(xiàn)相對(duì)缺失的狀態(tài)，并且與血清抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptides,CCP)、類風(fēng)濕因子(rheumatoidfactor,RF)和C反應(yīng)蛋白(C-reactionprotein,CRP)的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)在RA患者的牙菌斑、唾液和糞便中均明顯增加，并且與IgG水平呈正相關(guān)，與低中度病情活動(dòng)患者相比，病情高度活動(dòng)的RA患者中表達(dá)更高，而在經(jīng)過治療之后的患者能部分恢復(fù)。揭示某些菌群異常在RA的主要病理生理機(jī)制如瓜氨酸環(huán)化異常中具有重要的作用，可能直接參與疾病發(fā)生。

為了驗(yàn)證與RA相關(guān)的腸道菌群的診斷價(jià)值，研究者通過腸道宏基因組關(guān)聯(lián)方法構(gòu)建了疾病隨機(jī)森林分類器，通過對(duì)牙菌斑、唾液和糞便樣本的元基因檢測(cè)，形成的微生物菌群分類診斷模型對(duì)RA診斷的準(zhǔn)確率可顯著提高，其診斷準(zhǔn)確率接近100%。該分類診斷模型還可幫助判斷抗風(fēng)濕藥的療效，并區(qū)分RA的不同疾病病程，從而進(jìn)行疾病分層和藥物療效預(yù)警，同時(shí)研究者也對(duì)DMARDs治療前后RA患者的口腔和腸道微生物菌群的變化進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過治療之后的患者能部分恢復(fù)失調(diào)的腸道菌群，尤其是口腔樣本的結(jié)果。

理論意義和應(yīng)用價(jià)值

該宏基因組關(guān)聯(lián)分析定義了RA相關(guān)的腸道和口腔微生物的組成、功能的改變及DMARDs藥物治療后菌群部分恢復(fù)，口腔和腸道微生物之間具有一致性，并且與臨床指標(biāo)(如CRP、抗CCP、RF)相關(guān)，能初步地將RA患者分類，且糞便、牙菌斑和唾液標(biāo)本都容易取得。這一綜合性的調(diào)查表明，RA處于一個(gè)慢性炎癥的階段，致病性細(xì)菌過度生長(zhǎng)或免疫調(diào)節(jié)性的共生體細(xì)菌缺乏將會(huì)促進(jìn)或加重其發(fā)病。

這一研究結(jié)果被NatMed[30]和NatRewRheumatol[31]熱點(diǎn)評(píng)價(jià)。NatMed熱評(píng)：中國(guó)學(xué)者的這一發(fā)現(xiàn)不僅對(duì)RA的研究有重要作用，也提示我們健康微生物群的破壞導(dǎo)致異常的免疫調(diào)節(jié)可能是許多特發(fā)性炎癥性疾病的潛在共性，包括：代謝綜合征、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化[32]和IBD[33]等，這些情況的形成可能是一個(gè)常見的生態(tài)失調(diào)的表現(xiàn)，可能是類似環(huán)境驅(qū)動(dòng)、遺傳傾向等共同導(dǎo)致的，這樣一個(gè)模型可以解釋常見的RA合并某些潛在炎癥成分共存的疾病，最值得注意的是心臟病和抑郁癥[34]。宏基因組關(guān)聯(lián)分析研究的發(fā)展，提供了一個(gè)有利的條件，通過這些條件識(shí)別腸道微生物群的共性，并且進(jìn)一步分析身體其他部位的失調(diào)及炎癥紊亂之間的關(guān)系，從鳥槍法測(cè)序到元轉(zhuǎn)錄組分析的擴(kuò)展，使細(xì)菌的潛在功能及不同基因的表達(dá)都得到了特征性描述，也可以讓我們更進(jìn)一步了解微生物群。

結(jié)　　論

這一研究是國(guó)際上首次同時(shí)進(jìn)行的口腔和腸道微生物菌群元基因組關(guān)聯(lián)分析，揭示腸道菌群異常在人類重大慢性非感染性疾病中的機(jī)制和臨床意義，對(duì)此開展進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證將有利于深入了解RA發(fā)病機(jī)制，并有望對(duì)RA疾病分層、藥物療效預(yù)警及尋求新型治療靶點(diǎn)從而達(dá)到對(duì)疾病的精準(zhǔn)診療起到積極推動(dòng)作用，并為元基因組學(xué)輔助的RA個(gè)性化診療方案提供基礎(chǔ)。哈佛醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)家Diane Mathis說：“多年來一直懷疑，在人類和動(dòng)物模型中像關(guān)節(jié)炎一類的自身免疫疾病的形成依賴于腸道微生物群?，F(xiàn)在，這些懷疑開始在人體中得到證實(shí)，這是一個(gè)非常驚人的研究發(fā)現(xiàn)?！蔽覀兡壳斑€在繼續(xù)這方面的研究，進(jìn)一步觀察這一部分患者在治療2年后臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與腸道及口腔微生物的相關(guān)性。

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