曾 燕 曾 東倪學(xué)勤張 艷 祝 輝 唐雨蕊（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物微生態(tài)研究中心，動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安625014）

應(yīng)用PCR?DGGE技術(shù)比較綿羊瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃菌群的多樣性

曾 燕 曾 東?倪學(xué)勤?張 艷 祝 輝 唐雨蕊
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物微生態(tài)研究中心，動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安625014）

摘 要：本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－變性梯度凝膠電泳（PCR?DGGE）技術(shù)結(jié)合DGGE圖譜條帶的克隆和測序比較了綿羊瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃菌群的多樣性，同時(shí)對菌群進(jìn)行了聚類分析和主成分分析。結(jié)果表明：綿羊瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃內(nèi)容物DGGE圖譜的平均條帶數(shù)分別為18、13、16和15條；瘤胃和瓣胃內(nèi)菌群的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度均較高，分別為2．83、0．79、17．00和2．82、0．79、16．80，而網(wǎng)胃和皺胃內(nèi)容物較低，分別為2．52、0．70、12．60和2．73、0．76、15．40；聚類分析結(jié)果顯示不同胃的內(nèi)容物菌群具有一定差異，但不同動物個體相同胃的內(nèi)容物相似性系數(shù)均高于0．63；PCR?DGGE圖譜中測序的條帶大多數(shù)歸為擬桿菌門（Bacte?roidetes）和厚壁菌門（Firmicutes），優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）細(xì)菌、擬桿菌門（Bacte?roidetes）細(xì)菌、未培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌（uncultured rumen bacterium）、未培養(yǎng)細(xì)菌（uncultured bacterium）和韋榮球菌科（Veillonellaceae）細(xì)菌，特異性細(xì)菌為不動桿菌屬（Acinetobacter sp．）細(xì)菌和瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）細(xì)菌。結(jié)果提示，綿羊4個胃中均含有種類豐富和數(shù)量巨大的細(xì)菌，且隨著消化道部位由前往后的順序，菌群的多樣性呈現(xiàn)先高后降低再升高的趨勢。

關(guān)鍵詞：綿羊；胃；細(xì)菌；PCR?DGGE；聚類分析；主成分分析

成年哺乳動物胃腸道棲息著種類繁多且數(shù)量巨大的微生物，其數(shù)量是動物體細(xì)胞數(shù)的10倍左右［1］。宿主可為微生物提供良好的生長環(huán)境，而微生物通過促進(jìn)胃腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收維持動物的健康［2］。近年來，反芻動物依賴瘤胃微生物能將纖維素等物質(zhì)有效地轉(zhuǎn)化為動物產(chǎn)品成為了研究熱點(diǎn)［3］，由于采樣的難易程度不同，大多數(shù)都集中在對瘤胃和糞中微生物的研究［4－6］。然而，網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃也是反芻動物的標(biāo)志性消化器官，其中棲息的微生物及這些微生物對宿主的作用等信息大多數(shù)仍處于未知狀態(tài)。因此，反芻動物微生物的研究，尤其是4個胃的微生物的研究，對畜牧生產(chǎn)均具有指導(dǎo)意義，具有廣闊的前景。

目前，利用純培養(yǎng)技術(shù)，僅有11%左右的動物胃腸道微生物被分離培養(yǎng)［7］，仍有大量的微生物信息處于未知狀態(tài)。PCR?DGGE技術(shù)1993年首次被Muyzer等［8］應(yīng)用于研究微生物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，目前已被廣泛用于胃腸道、土壤、葡萄酒和海洋微生物的研究，能全面準(zhǔn)確地反映微生物菌群的結(jié)構(gòu)和組成。因此，本研究應(yīng)用PCR?DGGE技術(shù)結(jié)合DGGE圖譜中共性條帶和特異性條帶的克隆和測序，全面評估綿羊4個胃細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)和組成，為今后反芻動物胃腸道微生物的研究提供有價(jià)值的理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1．1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)動物來自四川省雅安市名山縣屠宰場，選擇5只同批次成年雄性蒙古羊作為采樣對象，體重為（48．16±1．48）kg。

1．2 試驗(yàn)材料

1．2．1 樣品的采集

無菌操作采集試驗(yàn)羊瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃新鮮內(nèi)容物，各采集3份，每份采集5 g，分裝至滅菌EP管中至液氮速凍，－80℃保存。

1．2．2 主要試劑和儀器

1．3 細(xì)菌總DNA的提取及16S rDNA V3區(qū)的擴(kuò)增

參照Li等［9］方法提取細(xì)菌總DNA。用核酸蛋白濃度測定儀測定細(xì)菌總DNA濃度后置－20℃保存?zhèn)溆?。大腸桿菌16S rRNA V3區(qū)通用引物［10］的上、下游序列分別為：5′－CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG G CA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG T－3′和5′－GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C－3′（帶下劃線部分為“GC”架子序列）。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：2×Taq MasterMix 12 μL，上、下游引物（10 pmol／μL）各1．0 μL，模板總DNA 1．0 μL，ddH2O 10 μL。擴(kuò)增條件為94℃4 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物片段大小用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．4 PCR?DGGE分析及條帶的克隆測序

參照倪學(xué)勤等［11］方法進(jìn)行樣品細(xì)菌的PCR?DGGE。選取35%～65%的凝膠電泳梯度（100%的變性劑包括7 mol／L尿素和40%甲酰胺），變性方向與電泳方向一致。電泳緩沖液為1×TAE，電壓為100 V，溫度為60℃，電泳時(shí)間為15 h。電泳結(jié)果經(jīng)硝酸銀染色后用Bio?Rad GS800 Calibrated Densitometer掃描成像。同時(shí)，回收DGGE圖譜上的共性條帶和特異性條帶，進(jìn)行克隆測序。測定序列采用Chromas 2軟件進(jìn)行編輯，非嵌合體序列在GenBank數(shù)據(jù)庫（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／）中進(jìn)行比對分析，尋找親緣關(guān)系最近的細(xì)菌或克隆。

1．5 計(jì)算公式

式中：H為多樣性指數(shù)（Shannon diversity in?dex）；Hmax為當(dāng)i為所有樣品總物種數(shù)時(shí)的多樣性指數(shù)；pi為物種i的相對豐度比例；E為均勻度（evenness）；R為豐富度（richness）；s為樣品在DGGE的條帶數(shù)。

1．6 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SAS 9．1軟件、Excel 2013和NTSYS 2．10軟件對PCR?DGGE圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行菌群多樣性分析、主成分分析（PCA）和聚類分析。

2　結(jié)果與分析

2．1 細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR?DGGE圖譜分析

PCR?DGGE圖譜中，強(qiáng)的電泳條帶代表了優(yōu)勢菌群，條帶位置和數(shù)量分別代表細(xì)菌種類和豐富度。由圖1可見，綿羊4個胃內(nèi)容物樣品均產(chǎn)生了豐富的電泳條帶，且相鄰胃的菌群結(jié)構(gòu)和組成相似，不相鄰胃的菌群結(jié)構(gòu)和組成存在一定差異。綿羊瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃內(nèi)容物的平均條帶數(shù)分別為18、13、16和15條。與瘤胃相比，瓣胃內(nèi)容物菌群的豐富度更高；與瓣胃相比，皺胃內(nèi)容物菌群豐富度更低。此結(jié)果可能是由于不同胃對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收不同，使其定植的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和組成存在差異。

2．2 PCR?DGGE圖譜多樣性分析

由表1可知，綿羊不同胃內(nèi)容物菌群的多樣性指數(shù)存在差異。瘤胃、瓣胃和皺胃內(nèi)容物菌群的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度均較高，分別為2．83、0．79、17．00和2．82、0．79、16．80及2．73、0．76、15．40，網(wǎng)胃內(nèi)容物菌群的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度較低，為2．52、0．70、12．60。

2．3 PCR?DGGE圖譜的聚類分析

PCR?DGGE圖譜結(jié)果（圖1）表明綿羊4個胃內(nèi)容物中均含有物種豐富且數(shù)量巨大的細(xì)菌，但聚類分析結(jié)果（圖2）顯示，綿羊瘤胃和網(wǎng)胃內(nèi)容物聚為一簇，相似性系數(shù)為0．62；瓣胃和皺胃內(nèi)容物聚為一簇，相似性系數(shù)為0．56。綿羊不同胃內(nèi)容物菌群具有一定差異，但不同動物個體、相同胃內(nèi)容物的相似性系數(shù)均高于0．63，表明動物個體差異對來自相同消化道部位樣品細(xì)菌的影響較小。

圖1　綿羊胃細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR?DGGE圖譜Fig．1 PCR?DGGE profiles of 16S rDNA V3 region of stomach bacteria from sheep

圖2　PCR?DGGE圖譜的聚類分析Fig．2 Cluster analysis of PCR?DGGE profiles

2．4 PCR?DGGE圖譜的PCA

PCR?DGGE圖譜的PCA（圖4）同聚類分析的結(jié)果一致。主成分因子1（PC1）的貢獻(xiàn)率為21．37%，主成分因子2（PC2）的貢獻(xiàn)率為15．11%；PC1明顯地將樣品分成2個部分，來自綿羊瘤胃和網(wǎng)胃內(nèi)容物主要分布在圖的左邊，瓣胃和網(wǎng)胃內(nèi)容物主要分布在圖的右邊；同樣，PC2明顯地將瘤胃、瓣胃內(nèi)容物同網(wǎng)胃、皺胃內(nèi)容物區(qū)別開來。由此可看出，綿羊4個胃內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)和組成既有相似之處，但又相互區(qū)別。

圖4　PCR?DGGE圖譜的PCAFig．4 PCA of PCR?DGGE profiles

2．5 綿羊胃的共性細(xì)菌和特異性細(xì)菌

從PCR?DGGE圖譜上共回收10個條帶（圖1箭頭所指），測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對，結(jié)果見表2。綿羊的4個胃中均棲息著數(shù)量龐大且菌群結(jié)構(gòu)豐富的細(xì)菌，含有大量的厚壁菌門（Firmicutes）細(xì)菌、擬桿菌門（Bacteroidetes）細(xì)菌、未培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌（uncultured rumen bacterium）、未培養(yǎng)細(xì)菌（uncultured bacterium）和韋榮球菌科（Veillonellaceae）細(xì)菌。而特異性條帶較少，如不動桿菌屬（Acinetobacter sp．）細(xì)菌和瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）細(xì)菌。

由表2可看出，有70%的測序結(jié)果與Gen?Bank數(shù)據(jù)庫中微生物的同源性高達(dá)100%，而條帶1、8和9在數(shù)據(jù)庫中比對分析后的相似性均達(dá)到了97%以上，說明試驗(yàn)中所測的DGGE條帶與已鑒定的微生物親緣性非常高。

3　討 論

本研究應(yīng)用PCR?DGGE技術(shù)分析綿羊胃的菌群。一般而言，動物在出生時(shí)其胃腸道幾乎未發(fā)育完全，但隨著消化器官的發(fā)育，其中的微生物種類和數(shù)量逐漸增多［12］，而瘤胃因其龐大的體積和嚴(yán)格的厭氧環(huán)境含有豐富的微生物。PCR?DGGE圖譜（圖1）顯示，綿羊的4個胃均具有種類復(fù)雜且數(shù)量巨大的細(xì)菌。菌群的多樣性指數(shù)結(jié)果（表1和圖2）表明，瘤胃、瓣胃和皺胃內(nèi)容物菌群的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度均較高，且隨著消化道部位由前往后的順序，呈現(xiàn)出先高后降低，再升高的趨勢，這與胃的功能和環(huán)境密切相關(guān)。

PCR?DGGE圖譜中條帶的測序結(jié)果（表2）顯示，瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃中均存在大量的厚壁菌門細(xì)菌、未培養(yǎng)擬桿菌門細(xì)菌、未培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌、韋榮球菌科細(xì)菌、不動桿菌屬菌和未培養(yǎng)瘤胃球菌屬細(xì)菌，說明綿羊胃中的細(xì)菌大多數(shù)來自厚壁菌門和擬桿菌門。同樣，大量研究表明，反芻動物胃腸道內(nèi)存在種類繁多且數(shù)量巨大的微生物，主要是厚壁菌門菌和擬桿菌門菌［13－15］。擬桿菌門菌是動物胃腸道的一類革蘭氏陰性菌，該類群在降解和發(fā)酵植物細(xì)胞壁多糖等有機(jī)物方面具有重要的作用［16］。本研究中，PCR?DGGE圖譜條帶的測序結(jié)果大多數(shù)歸為擬桿菌門菌，而厚壁菌門細(xì)菌相對較少，說明綿羊的4個胃的細(xì)菌在分解和消化吸收植物細(xì)胞壁多糖等方面發(fā)揮了重要的作用。Cunha等［17］研究巴西山羊的瘤胃液相和固相微生物，結(jié)果表明類桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌群。而Singh等［18］采用454 GS FLX高通量測序技術(shù)研究了飼喂4種不同精粗比飼糧的水牛瘤胃微生物，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門菌和變形菌均為優(yōu)勢菌。這均與本研究中的測序結(jié)果存在一定的差異，可能是由于動物品種及飼糧不同等因素引起的。結(jié)合PCR?DGGE圖譜和條帶的測序結(jié)果可看出，僅在瘤胃和網(wǎng)胃中存在大量的未培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌；而瓣胃和皺胃中存在大量的韋榮球菌科細(xì)菌，可能是由于各個胃在消化道的位置不同而引起的。有研究表明，瘤胃中存在大量球菌，尤其是白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）和黃色瘤胃球菌（Rumi?nococcus flavefaciens），在降解植物纖維素方面具有不可替代的作用［19－20］。而在本研究結(jié)果中，僅在皺胃檢測出瘤胃球菌，進(jìn)一步說明反芻動物消化道的其他部位也存在大量的未培養(yǎng)瘤胃球菌。

聚類分析（圖3）及PCA（圖4）表明，不同動物個體間相同消化道部位菌群的結(jié)構(gòu)和組成具有較高的相似性；同一動物個體不同消化道部位細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)和組成存在差異。PC1將瘤胃和網(wǎng)胃內(nèi)容物同瓣胃和皺胃內(nèi)容物分開，PC2將瘤胃和瓣胃內(nèi)容物同網(wǎng)胃和皺胃內(nèi)容物分開，可能是由相鄰消化道部位含有相似的營養(yǎng)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)在胃中的停留時(shí)間不同導(dǎo)致的。本研究的樣品雖然來自同一批次的綿羊，但由于動物個體的差異和飼糧組成的差異，所以來自相同消化道部位的不同動物間的菌群存在差異。Jami等［21］對健康荷斯坦奶牛個體間瘤胃微生物的研究發(fā)現(xiàn)所有動物個體均有共同的細(xì)菌，但個體間仍存在一定差異，這與本研究結(jié)果一致。本研究僅對綿羊的4個胃的細(xì)菌進(jìn)行了初步的研究，并不能代表全部的細(xì)菌信息，因此，每種細(xì)菌的數(shù)量差異還有待進(jìn)一步研究。

表2　PCR?DGGE圖譜共性條帶和特異性條帶Table 2 Common bands and special bands in PCR?DGGE profiles

4　結(jié) 論

①綿羊瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃優(yōu)勢菌群為厚壁菌門細(xì)菌、擬桿菌門細(xì)菌、未培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌、未培養(yǎng)細(xì)菌和韋榮球菌科細(xì)菌，特異性細(xì)菌為不動桿菌屬（Acinetobacter sp．）細(xì)菌和瘤胃球菌屬（Ru?minococcaceae）細(xì)菌。

②綿羊4個胃中均含有種類豐富和數(shù)量巨大的細(xì)菌，且隨著消化道部位由前往后的順序，菌群的多樣性呈現(xiàn)先高后降低再升高的趨勢。

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（編輯 王智航）

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A Comparison Study on Bacteria Diversity of Rumen，Reticulum，Omasum and Abomasum from Sheep Using PCR?DGGE Analysis

ZENG Yan ZENG Dong?NI Xueqin?ZHANG Yan ZHU Hui TANG Yurui
（Institute of Animal Microecology，College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province，Ya’an 625014，China）

?Corresponding author，ZENG Dong，professor，E?mail：zend＠sicau．edu．cn；NI Xueqin，professor，E?mail：xueqinni＠foxmail．com

Abstract：In order to compare the bacterial flora diversity of rumen，reticulum，omasum and abomasum from sheep，polymerase chain reaction?denaturing gradient gel electrophoresis（PCR?DGGE）analysis compounded with cloning and sequencing of bands in DGGE profiles were used，and cluster analysis and principal constitu?ent analysis（PCA）of bacterial flora were carried out．The results showed as follows：the average number of DGGE bands of contents in rumen，reticulum，omasum and abomasum was 18，13，16 and 15，respectively；Shannon diversity index，evenness and richness of bacteria in rumen and omasum were higher，which were 2．83，0．79 and 17．00，and 2．82，0．79 and 16．80，respectively，however，those of reticulum and abomasum were lower，which were 2．52，0．70 and 12．60，and 2．73，0．76 and 15．40，respectively；clustering analysis results suggested that there were some differences in bacterial flora among the contents in different stomachs，but the similarity coefficients from the same segment of stomach of different animals were all above 0．63；most of the sequenced bands belonged to Bacteroidetes and Firmicutes，and Bacteroidetes，F(xiàn)irmicutes，uncultured rumen bacterium，uncultured bacterium and Veillonellaceae were predominant in stomach，while the special bacteria were Acinetobacter sp．a(chǎn)nd Ruminococcaceae bacteria．In conclusion，there are rich kinds and large a?mount of bacteria in the four stomachs of sheep．With rearward moving of position of intestinal tract，the diver?sity increased firstly and then decreased and finally increased．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27 （1）：298?304］

Key words：sheep；stomach；bacteria；PCR?DGGE；cluster analysis；PCA

通信作者：?曾 東，教授，博士生導(dǎo)師，E?mail：zend＠sicau．edu．cn；倪學(xué)勤，教授，博士生導(dǎo)師，E?mail：xueqinni＠foxmail．com

作者簡介：曾 燕（1987—），女，四川內(nèi)江人，碩士研究生，從事動物微生態(tài)研究。E?mail：zengyanA＠foxmail．com

基金項(xiàng)目：教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金資助項(xiàng)目（200835?1）；四川省學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)基金資助

收稿日期：2014－07－08

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．01．036

文章編號：1006?267X（2015）01?0298?07

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：S826