李世召 郭 偉 杜 超 景宇飛 劉艷利申 靜 姚軍虎 楊小軍（西北農林科技大學動物科技學院，楊凌712100）

用高效液相色譜法檢測雞胚組織基因組DNA甲基化水平變化規(guī)律

李世召 郭 偉 杜 超 景宇飛 劉艷利申 靜 姚軍虎 楊小軍?
（西北農林科技大學動物科技學院，楊凌712100）

摘 要：本試驗旨在優(yōu)化用于基因組DNA甲基化水平檢測的高效液相色譜法，并初步探索雞胚發(fā)育過程中不同組織基因組DNA甲基化水平的變化規(guī)律。首先，試驗從DNA酶解體系和高效液相色譜儀檢測條件2個方面改進基因組DNA甲基化水平檢測方法；然后，以孵化第8、11、14和17天的科寶500肉雞胚胎為材料，利用改進的高效液相色譜法測定心臟、肝臟和肌肉的基因組DNA甲基化水平。結果表明：3種組織的基因組DNA甲基化水平均隨胚齡增加而升高，且雞胚發(fā)育后期（孵化第17天）肝臟的甲基化水平顯著高于心臟和肌肉（P＜0．05）；各胚齡心臟和肌肉的基因組DNA甲基化水平均差異不顯著（P＞0．05）。結果提示，優(yōu)化后的高效液相色譜法為快速、準確地獲取組織基因組DNA甲基化水平奠定了基礎；隨著雞胚發(fā)育的進行，基因組DNA甲基化水平逐漸升高，且在胚胎發(fā)育后期肝臟甲基化水平較高。

關鍵詞：高效液相色譜；肉雞；胚胎；DNA甲基化

表觀遺傳學是研究在不涉及DNA序列改變的情況下，引起基因表達調控的可遺傳變化的一門學科［1］。表觀遺傳學修飾在基因的表達調控中具有重要作用。DNA甲基化是最常見的一種表觀遺傳學修飾，可引起DNA構象、染色質結構及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，進而影響基因表達。胚胎期是表觀基因組重編程的關鍵時期，易受外界環(huán)境影響。研究表明，孕婦攝取葉酸可預防胎兒發(fā)生心血管疾病，而葉酸是一種可通過改變DNA甲基化來影響基因表達的甲基供體［2］。孕鼠飼糧中添加的富含甲基的營養(yǎng)物質，可通過改變相關基因特異位點“CpG島”的甲基化，加重后代的過敏性哮喘［3］。刺鼠胚胎期飼糧中的甲基供體可使胎兒相關基因啟動子區(qū)域甲基化而影響其表達，最終改變后代的毛皮顏色［4］。將懷孕大鼠在高劑量農藥中暴露一段時間后，后代成年后會出現(xiàn)器官損傷，而雄性子代精子出現(xiàn)的異常的DNA甲基化模式至少可持續(xù)4代［5］。因此，了解雞胚發(fā)育過程中DNA甲基化的變化規(guī)律，對于從胚胎期入手研究家禽表觀遺傳學具有重要意義。

目前，用于甲基化檢測的方法有亞硫酸鹽修飾后測序［如甲基化特異性PCR（methylation spe?cific PCR，MSP）］、甲基敏感擴增片段多態(tài)性（methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP）、甲基化DNA免疫沉淀（methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）和焦磷酸測序等。MSP法利用亞硫酸氫鹽可將未甲基化的C轉化為U，經PCR擴增后又轉變成T，而甲基化的C則不變，測序后比較修飾前后PCR產物的序列差異可獲得其中的甲基化信息［6］。此方法屬于位點特異性DNA甲基化檢測，只適于檢測已知基因中包含若干CpG位點的某一片段的甲基化狀態(tài)。MSAP法使用的一對同裂酶（HPaⅡ和MspⅠ）可識別基因組中相同的CCGG位點，產生甲基化敏感多態(tài)性片段，隨后進行PCR擴增，可明確甲基化狀態(tài)［7］。該方法最大的缺點是，無法識別非CCGG序列中的CG位點。MeDIP法應用5－甲基胞嘧啶抗體特異性識別并分離甲基化的DNA片段，進行高通量測序。這種方法費用昂貴，不適合多樣品的基因組DNA甲基化測序。焦磷酸測序法可測定基因組中大量存在且DNA甲基化高發(fā)的重復原件Alu和LINE?1（long interspread nucleotide ele?ment?1）的甲基化率，并以此代表基因組DNA甲基化的總體水平［8］，但該法得到的并非嚴格意義上的基因組DNA甲基化水平。高效液相色譜（HPLC）法能夠快速、準確測定基因組DNA甲基化水平，并可用于高通量混合樣本檢測，準確顯示目的片段所有CpG位點的甲基化情況［9］。

本試驗改進了基因組DNA提取方法、DNA酶解體系和HPLC檢測條件，通過檢測科寶（Cobb）500肉雞胚胎發(fā)育第8、11、14和17天心臟、肝臟和肌肉的基因組DNA甲基化水平，以初步了解雞胚發(fā)育過程中DNA甲基化水平的變化規(guī)律。

1　材料與方法

1．1 儀器和試劑

藍電孵化機（9TV－3A，北京藍天蛟電子技術有限公司），日立D－2000 HPLC儀［天美（中國）科學儀器有限公司］，Ultimate Polar?RP色譜柱（4．6 mm×250 mm，5 μm）［月旭材料科技（上海）有限公司］；脫氧胞苷（deoxycytidine，dC）（Sigma）和5－甲基脫氧胞苷（deoxy?5?methylcytidine，5?mdC）標準品（TCI）；RNase A，RNase T1，DNaseⅠ，F(xiàn)astAP Thermosensitive Alkaline Phos?phatase，ExonucleaseⅠ（Fermentas）。

1．2 孵化管理與樣品采集

選擇外形、重量均勻的Cobb 500肉雞種蛋100枚孵化，孵化條件如下。

溫度：前期（1～10 d）38．0～38．2℃，后期（11～18 d）37．8～38．0℃，落盤（19～21 d）37．5～37．8℃；相對濕度：45%～65%；翻蛋周期：120 min；翻蛋時間：180 s。

于孵化期第8、11、14和17天（分別記為E8、E11、E14和E17）分別選取發(fā)育良好的種蛋6枚，取雞胚心臟、肝臟和肌肉放入凍存管，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 樣品處理

DNA提取：苯酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1，體積比）法提取組織DNA。第2次抽提前，加RNase A至終濃度80 μg／mL，RNase T1至終濃度1 500 U／mL，混勻后37℃水浴1 h。提取的DNA溶于40 μL TE緩沖液中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA酶解：參照前人研究［9－13］，將DNA酶解體系設為150 μL，其中組織DNA約20 μg，醋酸銨（pH＝7．5）15 μL，DNaseⅠ10 μL，10×DNaseⅠBuffer（MgCl2）15 μL，F(xiàn)astAP Thermosensitive Al?kaline Phosphatase 10 μL，10×Alkaline Phosphatase Buffer 15 μL，ExonucleaseⅠ5 μL，10×Exonucle?aseⅠBuffer 15 μL，超純水補足至150 μL。37℃孵育4～5 h，過0．22 μm濾膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HPLC分析：色譜柱為Ultimate Polar?RP （4．6 mm×250．0 mm，5 μm）；流動相為0．2%（體積分數(shù)）磷酸；流速為1．3 mL／min；檢測波長為273 nm；進樣量為20 μL。

1．4 DNA甲基化水平計算

分別配制7種濃度（0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、20．0和50．0 mg／L）的dC和5?mdC標準品溶液，用于繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線計算樣品色譜圖中2種脫氧核苷峰面積對應的濃度（分別記為CdC和C5?mdC），則樣品基因組DNA的甲基化水平（methylation level，ML）為：

ML（%）＝100×C5?mdC／（C5?mdC＋CdC）。

1．5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 18．0統(tǒng)計軟件單因素方差分析（one?way ANOVA）過程對同一胚齡不同組織和不同胚齡同一組織的基因組DNA甲基化水平進行單因素方差分析，采用Duncan氏法對差異顯著處理進行多重比較，顯著水平為P＜0．05。

2　結果與分析

2．1 DNA酶解效果檢測

HPLC法檢測基因組DNA甲基化水平的前提是DNA必須完全酶解為單個脫氧核苷。為檢驗樣品DNA是否完全酶解為單個脫氧核苷，并比較組織DNA與酶解DNA，本試驗對酶解前后的組織DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示，基因組DNA已酶解為單個脫氧核苷。

圖1　DNA酶解效果Fig．1 Result of DNA digested by enzymes

2．2 DNA甲基化水平的計算

通過2種方法確定dC和5?mdC的色譜峰位置（圖2和圖3）：比較樣品洗脫峰和標準品洗脫峰的保留時間；在樣品中添加標準品，觀察色譜峰的變化。根據(jù)標準曲線［相對標準偏差（RSD）＝0．68%（n＝7）］（圖4）計算樣品中2種脫氧核苷的濃度，并通過公式得到樣品基因組DNA甲基化水平。

2．3 最低檢測限、最小定量限和回收率的測定

以信噪比為3和10確定的dC的最低檢測限（LOD）和最小定量限（LOQ）分別為0．015和0．045 mg／L，5?mdC的分別為0．097和0．323 mg／L。

分別配制5種不同濃度（1、2、5、10和20 mg／L）的dC和5?mdC標準品溶液，取已知dC 和5?mdC濃度的樣品進行加標回收率測定，每個標準品濃度重復3次，試驗結果見表1。

表1　脫氧胞苷和5－甲基脫氧胞苷的平均回收率Table 1 The average recovery of dC and 5?mdC（n＝3）　%

圖2　2種脫氧核苷標準品的色譜圖Fig．2 Chromatograms of 2 kinds of deoxynucleoside standard samples

2．4 雞胚不同組織基因組DNA甲基化水平檢測結果

2．4．1 雞胚不同組織基因組DNA甲基化水平隨胚齡的變化趨勢

由表2可知，雞胚心臟、肝臟和肌肉的基因組DNA甲基化水平均隨胚齡增加而升高。E14和E17心臟的基因組DNA甲基化水平顯著高于E8 和E11（P＜0．05）；各胚齡肝臟的基因組DNA甲基化水平均差異顯著（P＜0．05）；E8和E17肌肉的基因組DNA甲基化水平差異顯著（P＜0．05），E11和E14肌肉的基因組DNA甲基化水平分別與其他3個胚齡差異不顯著（P＞0．05）。

圖3　DNA樣品的色譜圖Fig．3 Chromatogram of DNA sample

圖4　2種脫氧核苷的標準曲線Fig．4 Standard curves of 2 kinds of deoxynucleoside

2．4．2 雞胚不同胚齡各組織基因組DNA甲基化水平比較

由表2可知，E8、E11和E14肝臟基因組DNA甲基化水平與其他2種組織均差異不顯著（P＞0．05），但E17肝臟基因組DNA甲基化水平顯著高于心臟和肌肉（P＜0．05）。各胚齡心臟和肌肉基因組DNA甲基化水平均差異不顯著（P＞0．05）。

3　討 論

3．1 HPLC法測定基因組DNA甲基化條件的優(yōu)化及注意事項

3．1．1 HPLC法測定基因組DNA甲基化條件的優(yōu)化

DNA分階段酶解［10，13］需要至少3次酶解和水浴，操作繁瑣且孵育時間長。本試驗采用了尹慧等［11］的酶解體系，一次性加入DNA酶解所需的核酸外切酶、內切酶和堿性磷酸酶，只經過1次水浴，并在保證酶解效果的前提下將酶解時間縮短至4～5 h。將酶解體系增加至150 μL，使經0．22 μm濾膜的濾液更多，保證足夠的濾液用于HPLC上樣前的潤洗和進樣。

表2　不同胚齡雞胚各組織基因組DNA甲基化水平Table 2 Genome DNA methylation level of different tissues at different chick embryo ages　%

根據(jù)脫氧核苷的性質，本試驗選擇0．2%（體積分數(shù)）磷酸作為流動相［11］。Ultimate Polar?RP色譜柱的最佳流速為0．8 mL／min，在保證色譜柱使用壽命和色譜峰分離效果的同時，為盡量縮短采樣時間，本試驗將流速設為1．3 mL／min。用于DNA酶解的關鍵酶全部購自同一家公司，改善了dC和5?mdC色譜峰的分離效果（圖2和圖3）。

DNA變性是指核酸雙螺旋堿基對的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，改變了核酸的天然構象和性質。將DNA樣本在100℃加熱3 min可實現(xiàn)DNA變性［13］。DNA甲基化水平檢測需在上樣檢測前徹底酶解為單個脫氧核苷，因此本試驗省去了DNA變性過程。終止酶解反應是為防止殘存酶液對后續(xù)反應產生影響，常通過高溫來實現(xiàn)，如65或85℃加熱10～15 min［11，13］。本試驗中，酶解后的DNA為核酸基本單位，且直接用于HPLC檢測，無后續(xù)反應，故省略。

3．1．2 HPLC法測定基因組DNA甲基化的注意事項

本試驗使用的HPLC法對DNA濃度和質量均有較高要求，建議用傳統(tǒng)方法提取。經檢驗，本試驗設置的體系最多可消化25 μg DNA。此上限內，增加用于酶解的DNA量可增加色譜峰面積，降低系統(tǒng)誤差。

5?mdC易氧化，如果DNA放置時間過長，酶解后的HPLC色譜圖中5?mdC所在峰右側會出現(xiàn)與主峰混合的小雜峰，造成積分誤差。因此，應盡早酶解DNA進行HPLC檢測。

酶解后的DNA體系，在過0．22 μm濾膜前后進行瞬時離心，可保證較多的液體用于HPLC上樣檢測。

3．2 雞胚各組織基因組DNA甲基化水平變化規(guī)律

在哺乳動物上的研究表明，表觀基因組于配子形成期和胚胎發(fā)育期經歷2次消除和重建［14］，而表觀基因組水平與其穩(wěn)定性和環(huán)境敏感性直接相關。傳統(tǒng)的靜態(tài)模型理論認為，表觀基因組的穩(wěn)定性與DNA甲基化和組蛋白修飾情況呈正比［15］。配子形成期和胚胎發(fā)育期的表觀基因組處于動態(tài)變化過程，易受外界環(huán)境影響。因家禽的胚胎發(fā)育環(huán)境區(qū)別于哺乳動物，本試驗研究了肉雞的胚胎發(fā)育期，以初步了解家禽胚胎發(fā)育過程中表觀基因組重編程的基本規(guī)律。

愛拔益加肉雞和紅原雞的DNA甲基化圖譜顯示，DNA甲基化集中在基因體和重復序列，轉錄起始位點和轉錄終止位點的甲基化水平較低［16］?；騿幼訁^(qū)域的甲基化與否與基因表達密切相關：啟動子甲基化抑制基因表達，去甲基化促進基因表達。當基因具有轉錄活性時，其啟動子處于低甲基化狀態(tài)，即開啟基因表達。染色體存在復雜的折疊結構，影響mRNA的轉錄效率，而DNA甲基化可改變染色體的空間結構，舒展折疊狀態(tài)，利于轉錄因子與基因結合，促進轉錄。研究表明，有活性X染色體的甲基化水平是無活性的2倍，且主要表現(xiàn)在基因體上，基因啟動子則呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)［17］。

雞胚發(fā)育分3個階段：孵化第1～4天發(fā)育內部器官，為發(fā)育早期；第5～15天發(fā)育外部器官發(fā)育階段，為發(fā)育中期；第16～19天是雞胚的生長階段，為發(fā)育后期。實際操作中，從雞胚發(fā)育第8天起能有效分離足夠的心臟、肝臟和肌肉組織用于DNA提取，因此，本試驗選取的第1個時間點為雞胚發(fā)育第8天。試驗結果表明，雞胚發(fā)育過程中基因組DNA甲基化水平同哺乳動物一樣呈逐漸升高的趨勢。

雞胚發(fā)育中期，骨骼和肌肉等功能相對單一的外部器官未完全發(fā)揮功能，DNA甲基化水平升高緩慢；雞胚發(fā)育后期，各組織器官體積快速增大，充分發(fā)揮功能以備出殼，基因中有礙mRNA轉錄的結構可能通過甲基化作用得以改善，使DNA甲基化水平隨之迅速升高。部分研究認為，雞胚在孵化后期出現(xiàn)甲基化高峰可能與該時期的胚胎體重增加有關［18］。

研究表明，同種動物不同組織的基因組DNA甲基化模式存在差異［19－21］。本試驗中，肝臟的甲基化模式明顯異于心臟和肌肉，可能與肝臟系生化代謝中心，各種mRNA轉錄旺盛，而心臟和肌肉同屬肌肉組織，功能相對單一有關。家雞胚胎發(fā)育早期DNA甲基化的MSAP分析結果顯示，家雞胚胎甲基化呈現(xiàn)較高的組織特異性，其中肝臟的甲基化程度較高，肺臟較低，腎臟和胸肌的甲基化水平相近。隨著雞胚發(fā)育的進行，DNA甲基化水平呈逐漸增高的趨勢［18］。本試驗結果與之相同。

4　結 論

①本試驗應用HPLC法檢測了雞胚基因組DNA甲基化水平，優(yōu)化后的HPLC法簡化了操作步驟，縮短了酶解時間，改善了dC和5?mdC色譜峰的分離效果，為快速、準確獲取各種組織基因組DNA甲基化水平奠定了基礎。

②隨著雞胚發(fā)育的進行，各組織基因組DNA甲基化水平逐漸升高，且雞胚發(fā)育后期肝臟呈現(xiàn)較高的甲基化水平。

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（編輯 菅景穎）

Analysis of Variation of Genome DNA Methylation Level of Chick Embryo Tissues with High Performance Liquid Chromatography

LI Shizhao GUO Wei DU Chao JING Yufei LIU Yanli SHEN Jing YAO Junhu YANG Xiaojun?
（College of Animal Science and Technology，Northwest A＆F University，Yangling 712100，China）

?Corresponding author，associate professor，E?mail：yangxj＠nwsuaf．edu．cn

Abstract：This experiment was conducted to develop the high performance liquid chromatography（HPLC）method for genome DNA methylation level detection，and to explore the variation of genome DNA methylation level of chick embryo tissues preliminary．Firstly，the genome DNA methylation level detection method was improved from 2 aspects including DNA enzymatic hydrolysis system and HPLC instrument detection condi?tion；then，the DNA methylation level of heart，liver and muscle at embryonic ages of 8，11，14，17 days of Cobb 500 broiler chick embryo was detected by improved HPLC method，respectively．The results showed that the genome DNA methylation level of 3 tissues was increased with embryonic age increasing and that of liver was significantly higher than that of heart and muscle in later embryonic development（embryonic age of 17 days）（P＜0．05）．Heart and muscle showed no significant difference in DNA methylation level among all em?bryonic ages（P＞0．05）．It is concluded that the developed HPLC laid a good foundation for genome DNA methylation determination of tissues rapidly and accurately．Otherwise，the genome DNA methylation level ri?ses gradually with chick embryonic age increasing，and that of liver is higher in later embryonic development．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（1）：171?177］

Key words：HPLC；chick；embryo；DNA methylation

通信作者：?楊小軍，副教授，碩士生導師，E?mail：yangxj＠nwsuaf．edu．cn

作者簡介：李世召（1987—），男，河北邢臺人，博士研究生，從事家禽營養(yǎng)表觀遺傳學研究。E?mail：lishizhao10160＠163．com

基金項目：國家自然基金項目（31272464，31001017）；教育部新世紀優(yōu)秀人才（NCET?12?0476）；陜西省科技新星基金（2012KJXX?18）

收稿日期：2014－08－24

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．01．021

文章編號：1006?267X（2015）01?0171?07

文獻標識碼：A

中圖分類號：S188