周前進(jìn) 陳先鋒, 蔡 怡 段麗君 段維軍 苗 亮 陳 炯①

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 2. 寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院 寧波 315012)

孔石莼(Ulva pertusa)屬于綠藻綱, 石莼目, 石莼科, 石莼屬。石莼屬(Ulva)藻類呈全球性分布, 多數(shù)種類生活在溫帶至亞熱帶海洋中, 部分生長在高潮帶至低潮帶和大干潮線附近巖石上或石沼中。石莼屬藻類富含蛋白和多種微量元素, 具有很高的食用及藥用價值(Torres et al, 2014; Montingelli et al, 2015;Ghadiryanfar et al, 2016)。作為重要的經(jīng)濟(jì)藻類, 孔石莼(U. pertusa)、滸苔(U. prolifera)等已得到越來越多的開發(fā)利用。然而, 當(dāng)石莼屬藻類脫離固著基, 形成大量的漂浮增殖群體時, 將導(dǎo)致綠潮的暴發(fā), 破壞底棲生態(tài)系統(tǒng)。自20世紀(jì)70年代初法國布列塔尼沿海首次報道以來, 綠潮發(fā)生范圍已遍及歐洲沿海、美國東西海岸、東亞和東南亞沿海以及澳大利亞等國, 成為世界性的海洋環(huán)境問題(Smetacek et al, 2013)。

多年以來, 石莼屬等綠潮藻的分類鑒定主要依賴于顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察, 通常以其形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征等作為主要的分類依據(jù)。然而, 石莼屬藻類不同生長階段的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和藻體形態(tài)有著很好的可塑性,易隨季節(jié)和環(huán)境的變化而變化(Blomster et al, 1999,2002), 導(dǎo)致形態(tài)學(xué)分類比較困難。因此, 以 PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)引入到綠潮藻類的檢測。其中,rDNA-ITS序列、rDNA-18s序列、二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因(rbcL)等因其種間較大的差異性, 通常用作鑒定的靶標(biāo), 應(yīng)用于藻類的系統(tǒng)分類和鑒定過程(Blomster et al, 2002; Wang et al, 2010; Lin et al,2012); 由于該類技術(shù)有一定的儀器依賴性, 要在特定環(huán)境下由專業(yè)人員操作, 僅限于在實驗室開展。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是2000年發(fā)展起來的一種新的核酸擴(kuò)增方法(Notomiet al, 2000)。相較于PCR技術(shù),LAMP方法需針對靶序列的不同區(qū)域設(shè)計6—8條引物, 這些引物在反應(yīng)過程中需完全與靶序列匹配才能完成擴(kuò)增反應(yīng), 使得該方法具有良好的特異性。LAMP反應(yīng)依賴于一種具有鏈置換功能的BstDNA聚合酶, 恒溫條件下即可完成核酸的大量擴(kuò)增, 無需類似于 PCR的反復(fù)升降溫過程, 使得儀器設(shè)備的依賴性大幅度降低。因此, 自該技術(shù)發(fā)明以來已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原的檢測(Niuet al, 2012;Nieet al, 2013; Notomiet al, 2015)。LAMP產(chǎn)物的檢測主要以瓊脂糖凝膠電泳或濁度檢測為主, 仍依賴于凝膠成像系統(tǒng)和濁度儀等儀器(Paridaet al, 2008);依賴于熒光染料的裸眼觀察和實時熒光 LAMP法在某些微生物的檢測中也取得了應(yīng)用, 但非特異性擴(kuò)增引起的假陽性成為限制該類檢測手段廣泛應(yīng)用的重要因素(Moriet al, 2001, 2004; Schnetzingeret al,2013)。LAMP-LFD技術(shù)是利用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行LAMP反應(yīng), 實現(xiàn)核酸的幾何級數(shù)擴(kuò)增, 隨后將生物素標(biāo)記的 LAMP產(chǎn)物與異硫氰酸熒光素標(biāo)記的特異性探針進(jìn)行雜交, 雜交產(chǎn)物在經(jīng)生物素抗體和異硫氰酸熒光素抗體處理的橫向流動試紙條 (lateral flow dipstick, LFD)上完成檢測, 陽性的雜交產(chǎn)物會在 LFD的檢測線位置呈現(xiàn)特征性的條帶。相較于其它的LAMP產(chǎn)物檢測手段, LFD無需任何儀器設(shè)備,易于操作和攜帶; 而且可通過探針的特異性雜交進(jìn)一步篩選擴(kuò)增產(chǎn)物, 降低了結(jié)果的假陽性。該技術(shù)在傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)和海豚鏈球菌等多種水產(chǎn)病原微生物的基層即時檢測中展示了良好的適用性(Dinget al, 2010; 王瑞娜等, 2014); 同時, 該方法在綠潮藻扁滸苔的的鑒別診斷中也展示了一定的應(yīng)用潛力(陳先鋒等, 2015)。

本研究根據(jù)孔石莼核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(rDNA-ITS)的保守區(qū)設(shè)計3對引物和1條異硫氰酸熒光素標(biāo)記探針, 優(yōu)化反應(yīng)條件后, 建立 LAMPLFD技術(shù), 為水體環(huán)境中孔石莼的定期檢測和快速檢測提供一種快捷可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 藻種分離株及培養(yǎng)

實驗所用的各微藻分離株(赤潮異彎藻、東海原甲藻、塔瑪亞歷山大藻、無紋環(huán)溝藻、錐狀斯克里普藻等)由寧波大學(xué)海洋學(xué)院藻種實驗室提供。實驗中涉及的石莼屬綠藻經(jīng)母藻細(xì)斷法分離后(Hiraokaet al, 1998), 按Duan等(2012)的方法于本實驗室培養(yǎng)、保存。具體所用藻類見表1, 孔石莼分離株 S66用于 LAMP條件優(yōu)化, 靈敏度優(yōu)化, 特異性分析等試驗。

表1 實驗過程中使用的藻類分離株Tab.1 Algal species used in LAMP-LFD assay

1.2 藻類DNA的制備

按照植物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)的步驟, 提取各藻類分離株的基因組 DNA(Qiagen, Hilden, 德國)。獲取的基因組 DNA溶解于50 μL的無菌去離子水中, 經(jīng) Nanodrop 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, 美國)測定濃度后用作標(biāo)準(zhǔn)品, –30°C 貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物和探針設(shè)計

根據(jù)孔石莼的 rDNA-ITS序列(GenBank登錄號:HM584747), 在保守區(qū)域設(shè)計 3對特異性引物(包括上游外引物UpeITS-F3、下游外引物UpeITS-B3、上游內(nèi)引物 UpeITS-FIP、下游內(nèi)引物 UpeITS-BIP, 以及環(huán)引物 UpeITS-LF和 UpeITS-LB), 用于 LAMP實驗(表 2,圖 1)。此外, 基于該擴(kuò)增區(qū)段設(shè)計 1條 DNA探針UpeITS-HP用于LFD雜交試驗(表2, 圖1)。其中, 上游內(nèi)引物 UpeITS-FIP的 5′端進(jìn)行生物素(biotin)標(biāo)記, 探針UpeITS-HP的5′端進(jìn)行異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記。同時, 以外引物UpeITS-F3和UpeITS-B3進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增片段大小為360 bp。引物的合成和標(biāo)記均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

表2 孔石莼rDNA-ITS序列的LAMP-LFD引物和探針序列Tab.2 The primers and DNA probe targeting rDNA-ITS of U. pertusa used in LAMP-LFD assay

圖1 孔石莼rDNA-ITS序列的LAMP引物設(shè)計示意圖Fig.1 Design of primers and DNA probe targeting

1.4 LAMP反應(yīng)條件確立

LAMP反應(yīng)體系參照Ding等(2010), 具體組成包括(25 μL): UpeITS-F3 和 UpeITS-B3 各 0.2μmol/L,UpeITS-FIP和 UpeITS-BIP各 1.6μmol/L, UpeITS-LF和 UpeITS-LB 各 0.4μmol/L, Tris-HCl (pH 8.80)20mmol/L, KCl 10mmol/L, (NH4)2SO410mmol/L,MgSO46.5mmol/L, dNTPs 1.4mmol/L, betaine 0.8mol/L, Triton X-100 0.1%,BstDNA聚合酶(New England BioLabs, 美國) 8U, 藻類基因組 DNA標(biāo)準(zhǔn)品 1μL, 無菌去離子水補(bǔ)足 25μL體系。對于反應(yīng)條件的優(yōu)化, 主要從反應(yīng)溫度和時間兩個方面考慮。BstDNA聚合酶的最佳活性溫度范圍在 60—65°C, 根據(jù)已經(jīng)建立的多個LAMP方法, 我們得出63°C和65°C是最為常用的溫度。因此, 本研究中LAMP反應(yīng)的溫度設(shè)定為63°C, 并在此基礎(chǔ)上完成了引物的篩選。為進(jìn)一步分析DNA模板濃度與LAMP反應(yīng)效率之間的關(guān)系, 我們在 LAMP反應(yīng)體系中加入 0.1 mmol/L SYTO 9 熒光染料(Invitrogen,美國), 在晶芯RT-Cycler實時熒光定量 PCR儀(博奧生物有限公司,中國)上進(jìn)行 LAMP反應(yīng)(即實時熒光 LAMP反應(yīng)),據(jù)此可實時觀察反應(yīng)產(chǎn)物的生成情況。操作可大致概括為: 將孔石莼S66的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以10倍濃度單位進(jìn)行梯度稀釋, 取 3.04×102、3.04×101、3.04×100、3.04×10–1、3.04×10–2、3.04×10–3和 3.04×10–4pg/μL 等7個濃度的基因組 DNA 為模板, 在 63°C下進(jìn)行LAMP反應(yīng), 根據(jù)起峰時間和擴(kuò)增強(qiáng)度分析反應(yīng)時間與模板濃度之間的關(guān)系, 并初步確定 LAMP反應(yīng)的時間; 實時熒光LAMP的反應(yīng)程序如下: 63°C 1min;63°C 15s 和 63°C 45s, 60 個循環(huán), 于每個循環(huán)的63°C 45s 末端收集熒光信號。在此基礎(chǔ)上, 分別選取較高濃度和最低檢測濃度的基因組 DNA為模板, 反應(yīng)時間依次設(shè)置為10、20、30、40、50和60min, 進(jìn)行 LAMP反應(yīng), 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析, 最終確定其反應(yīng)時間。

1.5 利用LFD檢測LAMP產(chǎn)物

經(jīng)biotin標(biāo)記的LAMP反應(yīng)結(jié)束后, 向反應(yīng)體系中加入 2μL 10pmol/μL 的探針 UpeITS-HP, 63°C 雜交5 min, 最后80°C溫育5min終止反應(yīng), 反應(yīng)產(chǎn)物可利用LFD試紙條(Milenia GenLine HybriDetect, Milenia Biotec, 德國)檢測, 具體操作如下: 取 80μL Buffer(Milenia GenLine HybriDetect, Milenia Biotec, 德國)于1.5mL離心管內(nèi), 加入5μL雜交液混勻, 將試紙條檢測端豎直浸沒預(yù)混液中反應(yīng)5min, 肉眼判斷結(jié)果。當(dāng)FITC標(biāo)記的探針與biotin標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交后, 雜交產(chǎn)物與膠體金標(biāo)記的 FITC抗體結(jié)合形成的三元復(fù)合物結(jié)合在帶有 biotin抗體的檢測線上;多余的探針則與膠體金標(biāo)記的FITC抗體結(jié)合后越過檢測線, 最終結(jié)合在質(zhì)控線上。

1.6 LAMP-LFD的特異性驗證

選擇滸苔(U. prolifera) XS5、曲滸苔(U. flexuosa)SDF12、緣管滸苔(U. linza) HS42、U. ohnoi FJ4等常見石莼屬綠藻分離株, 以及赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo) H1、東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、NMBjah045塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)NMBjah048、無紋環(huán)溝藻(Gyrodinium instriatum)NMBjah046和錐狀斯克里普藻(Scrippsiella trochoidea)NMBjah044等國內(nèi)常見微藻種類, 用于 LAMP-LFD的特異性實驗。用于特異性實驗的各藻類分離株的模板濃度統(tǒng)一調(diào)整為 1.0×102pg/μL, 產(chǎn)物分別采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和LFD進(jìn)行檢測。

1.7 LAMP-LFD的靈敏度分析

取稀釋后的孔石莼分離株S66的6個不同濃度的基因組 DNA (3.04×102—3.04×10–3pg/μL)為模板, 按優(yōu)化后的體系和條件進(jìn)行有生物素標(biāo)記的 LAMP反應(yīng), 擴(kuò)增產(chǎn)物分別采用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳和 LFD進(jìn)行檢測。

以上述6個濃度的基因組DNA為模板, 外引物UpeITS-F3和 UpeITS-B3為引物, 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。25μL PCR 反應(yīng)體系, 包括: 10×PCR Buffer 2.5μL,dNTPs (0.25mmol/L) 2μL, 0.2μmol/L UpeITS-F3 1μL,0.2μmol/L UpeITS-B3 1μL, 5U/μL rTaq DNA 聚合酶(TaKaRa, 大連, 中國)0.25μL, 基因組NDA模板1μL,用無菌去離子水補(bǔ)足25μL體系。PCR反應(yīng)程序如下:94°C 預(yù)變性 2min; 94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s, 30個循環(huán); 72°C延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 LAMP-LFD的重復(fù)性實驗

重新培養(yǎng)孔石莼分離株S66, 平行制備3個樣品,按步驟1.2的方法提取基因組DNA, 測定濃度后將濃度稀釋至 LAMP-LFD的最低檢測濃度, 并以此為模板, 進(jìn)行有生物素標(biāo)記的LAMP反應(yīng), 產(chǎn)物分別采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和LFD進(jìn)行檢測。

1.9 海水樣品檢測

從福建和青島等地區(qū)收集海水樣品17份。樣品經(jīng) 100目的篩絹網(wǎng)過濾后, 各取 400mL水樣培養(yǎng)于500mL的三角燒瓶中若干天, 至成熟藻體長成, 培養(yǎng)方法參照Duan等(2012)所述。成熟藻體用于形態(tài)學(xué)鑒定。另取篩絹網(wǎng)濾后水樣250mL按步驟1.2的方法提取基因組DNA, 利用LAMP-LFD和PCR進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)時間的優(yōu)化

在63°C條件下, 以不同濃度的基因組DNA為模板進(jìn)行的實時熒光 LAMP實驗結(jié)果表明, 當(dāng)模板濃度在 3.04×102pg/μL 至 3.04×10–2pg/μL 范圍內(nèi)均可獲得明顯擴(kuò)增(圖 2A), 起峰時間隨模板濃度降低而增加(圖2A), 范圍約在17—33min之間(圖2A, 2B), 呈典型的線性相關(guān)性(圖2B)。各反應(yīng)均在約50min時,相對熒光強(qiáng)度達(dá)到平臺期(圖 2A)。當(dāng)以較高濃度(3.04×102pg/μL)的基因組 DNA 為模板時, LAMP 擴(kuò)增 30min即可通過瓊脂糖凝膠電泳的方式檢測到明顯的梯形條帶, 反應(yīng)至 40min及以后產(chǎn)物濃度不再明顯增加(圖 2C)。當(dāng)以較低濃度的基因組 DNA(3.04×10–2pg/μL)為模板時, 發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時間達(dá)到 40min才能觀察到明顯的梯形條帶, 至 50min及以后產(chǎn)物濃度不再顯著增加(圖 2D), 與擴(kuò)增曲線的結(jié)果(圖2A)相一致。因此, 確定 LAMP的最適反應(yīng)時間為50min。

2.2 LAMP-LFD檢測的特異性

除孔石莼外, 選擇其它9株國內(nèi)常見的石莼屬綠藻或微藻的基因組 DNA(1.00×102pg/μL)為模板, 進(jìn)行有生物素標(biāo)記的實時熒光 LAMP反應(yīng), 條件為63°C反應(yīng)50min。結(jié)果表明, 以孔石莼的基因組DNA為模板的LAMP反應(yīng), 15min左右即出現(xiàn)明顯“S”形熒光曲線(圖 3A), 利用瓊脂糖凝膠電泳檢測也出現(xiàn)明顯的梯形條帶(圖3B), LFD的檢測線位置也出現(xiàn)明顯的條帶(圖3C); 而以其它9種藻類基因組DNA為模板時, 實時熒光曲線呈光滑曲線, 未見明顯擴(kuò)增(圖3A), 瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果未呈現(xiàn)梯形條帶(圖3B),LFD的檢測線位置也未能檢測到明顯條帶(圖 3C),檢測結(jié)果為陰性。

2.3 LAMP-LFD檢測的靈敏度

圖2 LAMP檢測孔石莼最適反應(yīng)時間的確定Fig.2 Time optimization of LAMP for detection of U. pertusa

圖3 LAMP(A、B)和LAMP-LFD(C)的特異性實驗結(jié)果Fig.3 Specificity test of LAMP (A, B) and LAMP-LFD (C) for detection of U. pertusa

圖4 LAMP(A)、LAMP-LFD(B)和PCR(C)檢測孔石莼的靈敏度比較Fig.4 Comparison in detection limit to U. pertusa by LAMP (A), LAMP-LFD (B), and PCR (C)

結(jié)果表明, 當(dāng)孔石莼的基因組 DNA模板濃度稀釋至3.04×10–2pg/μL時, 利用瓊脂糖凝膠電泳仍可清晰地檢測到梯形條帶(圖4A), LFD檢測線位置也呈現(xiàn)明顯的條帶(圖 4B); 當(dāng)模板濃度進(jìn)一步稀釋至3.04×10–3pg/μL 時, 瓊脂糖凝膠電泳未能檢測到梯形條帶(圖 4A), LFD 檢測線位置也未見條帶(圖 4B),結(jié)果陰性, 該結(jié)果與實時熒光 LAMP的檢測結(jié)果一致(圖2A); 以外引物UpeITS-F3和UpeITS-B3為特異性引物的PCR反應(yīng), 檢測靈敏度為3.04×101pg/μL(圖 4C)。上述結(jié)果表明 LAMP-LFD 的靈敏度可達(dá)3.04×10–2pg/μL, 是常規(guī) PCR 方法靈敏度的 1000倍。

2.4 LAMP-LFD檢測的重復(fù)性

結(jié)果表明, 以靈敏度濃度(約 3.04×10–2pg/μL)的孔石莼基因組DNA為模板, 在63°C反應(yīng)50min條件下進(jìn)行的LAMP反應(yīng), 產(chǎn)物利用LFD試紙條和瓊脂糖凝膠電泳兩種方式檢測, 均能穩(wěn)定地檢測到目的產(chǎn)物的有效擴(kuò)增(圖 5); 以無菌去離子水為模板時,結(jié)果皆為陰性(圖5); 這說明孔石莼的LAMP-LFD方法具有良好的技術(shù)重復(fù)性。

2.5 LAMP-LFD檢測海水樣品中藻類的適用性分析

從青島和福建等地區(qū)采集 17份海水樣品, 對LAMP-LFD方法應(yīng)用于野外樣本檢測的適用性進(jìn)行分析。對收集樣本利用傳統(tǒng)的顯微觀察方法鑒定發(fā)現(xiàn)來自青島的ZQ-5、TD-4、S73、S77以及S78等5個樣品為孔石莼(表 3); LAMP-LFD的檢測結(jié)果表明青島的ZQ-4、ZQ-5、TD-2、TD-4、S73、S77以及S78為孔石莼(表 3); 利用 PCR的方法同樣獲得青島的ZQ-4、ZQ-5、TD-2、TD-4、S73、S77以及S78為孔石莼(表3), 其余樣品呈陰性。

3 討論

富營養(yǎng)化海區(qū)暴發(fā)的綠潮災(zāi)害已逐漸成為我國某些海域的常態(tài)化現(xiàn)象, 嚴(yán)重影響到當(dāng)?shù)氐暮ＫB(yǎng)殖和旅游業(yè)(Hiraoka et al, 2004; Sun et al, 2008)。研究證實, 原本多數(shù)具有較好的食用和藥用價值的石莼屬藻類如滸苔和孔石莼等, 如今已成為導(dǎo)致綠潮災(zāi)害頻發(fā)的主要因素(Wang et al, 2015; Zhou et al,2015)。傳統(tǒng)的基于藻類形態(tài)學(xué)特征的顯微鏡觀察方法, 需經(jīng)過海水樣本的過篩、培養(yǎng)等步驟培養(yǎng)出藻體,除對培養(yǎng)設(shè)施和操作人員有較高要求外, 整個培養(yǎng)周期過長(30d左右), 不能及時有效的反映藻類的分布情況。因此, 本研究以孔石莼的作為檢測靶標(biāo), 建立了快速、準(zhǔn)確的 LAMP-LFD方法, 為孔石莼的快速篩選和鑒定提供了一種可靠方法。

圖5 LAMP(A)和LAMP-LFD(B)的重復(fù)性實驗Fig.5 Reproducibility of LAMP-LFD(A) and LAMP (B) for detection of U. pertusa

表3 利用顯微觀察、LAMP-LFD以及PCR方法對海水樣品中孔石莼的檢測結(jié)果Tab.3 Detection of U. pertusa from field samples by microscopic examination, LAMP-LFD, and PCR

耗時短是目前核酸檢測類方法追求的重要目標(biāo)。LAMP的擴(kuò)增反應(yīng)通?？稍?1h內(nèi)完成, 尤其添加環(huán)引物, 可明顯縮短LAMP的反應(yīng)時間, 這也是LAMP方法相較于基于 PCR原理的分子檢測技術(shù)的重要優(yōu)點(diǎn)。本研究中, 在添加環(huán)引物的前提下, 當(dāng) DNA模板濃度較高, LAMP反應(yīng)在20min之內(nèi)即可出現(xiàn)陽性擴(kuò)增(圖 2A); 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn), 30min時即可觀察到明顯的梯形條帶(圖 2C); 當(dāng)模板濃度降低至最低檢測濃度時, 利用瓊脂糖凝膠電泳的方法在 40min也可以清晰地檢測到梯形條帶, 反應(yīng)至50min左右時, 產(chǎn)物量即可達(dá)到最大值(圖2D)。當(dāng)使用LFD檢測時, LAMP產(chǎn)物只需經(jīng)過與特異性探針雜交5min, 再將LFD試紙條浸沒入添加有雜交產(chǎn)物的反應(yīng)液 3—5min, 即可完成結(jié)果判讀。因此, 考慮到從LAMP反應(yīng)開始計算, 整個檢測時程在1h左右。除此之外, LAMP反應(yīng)的體系組成也是建立LAMP方法過程中重點(diǎn)考慮的因素。本研究使用的體系組成主要參考自Ding等(2010)的方法; 在此基礎(chǔ)上, 通過添加熒光染料SYTO 9, 利用熒光曲線得出LAMP擴(kuò)增的起峰時間與 DNA的濃度成線性關(guān)系, 模板濃度約低, LAMP反應(yīng)的起峰時間越延遲(圖2B)。

由于近年來石莼屬綠藻引發(fā)的綠潮災(zāi)害逐漸引起人們的重視, 多種基于核酸的分子檢測技術(shù)在綠潮藻類的檢測與鑒定中取得了應(yīng)用。其中, 基于PCR原理的核酸擴(kuò)增技術(shù)占多數(shù)。Liu等(2012)借助于核酸測序技術(shù), 對 2007—2011年間江蘇省近海的綠潮藻類情況進(jìn)行了調(diào)查, 發(fā)現(xiàn)滸苔(U. prolifera)能夠抵抗該海域強(qiáng)烈的環(huán)境變化, 是該海域的主要優(yōu)勢藻類。Duan等(2012)借助于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因(rbcL)以及5S rDNA等藻類常用的分子標(biāo)志, 對采集于黃海的部分樣本的藻類信息進(jìn)行了分析, 發(fā)現(xiàn)該海域中存在有扁滸苔、孔石莼、緣管滸苔, 以及滸苔等多種綠潮藻類。Xiao等(2013)基于ITS序列建立了PCR-RFLP技術(shù), 應(yīng)用于黃海海域石莼屬和盤苔屬藻類的鑒別。Zhao等(2015)利用建立的PCR-ISSR技術(shù)(PCR-inter-simple sequence repeat)對黃海海域的漂浮滸苔分析發(fā)現(xiàn), 滸苔的一個獨(dú)特的生態(tài)型是引起全球性綠潮的重要原因, 固著生長的滸苔種類不是該生態(tài)型的物種來源, 這兩種不同生活方式的滸苔種之間很難發(fā)生基因漂流現(xiàn)象。Zhang等(2015)建立了熒光原位雜交技術(shù)(FISH), 該技術(shù)無需依賴于 PCR的核酸擴(kuò)增, 借助于針對滸苔5S rDNA序列的特異性探針即可將滸苔與緣管滸苔、曲滸苔、扁滸苔、孔石莼, 以及盤苔屬藻類區(qū)分開來。檢測靈敏度是核酸檢測類技術(shù)的重要指標(biāo)。段維軍等(2012)針對扁滸苔ITS序列建立的PCR方法最低可檢測到10 pg的藻類基因組DNA; 本實驗室先前也針對扁滸苔的rDNA-ITS序列建立了LAMP-LFD技術(shù), 最低可檢測到 0.1 pg的扁滸苔基因組 DNA(陳先鋒等,2015)。Chen等(2016)基于多重PCR的原理建立的基因芯片技術(shù)能夠特異性檢測滸苔、扁滸苔等多種藻類,最低檢測靈敏度可達(dá)0.5 ng的基因組DNA。本研究建立的 LAMP-LFD技術(shù), 能夠?qū)⒖资慌c滸苔、曲滸苔和緣管滸苔等加以區(qū)分, 最低可檢測到 3.04×10–2pg/μL 的孔石莼基因組DNA, 是以UpeITS-F3和UpeITS-B3為特異性引物的PCR方法的1000倍。17個海水樣本的檢測結(jié)果表明, LAMP-LFD方法檢測孔石莼與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果基本一致。因此, 該方法作為一種快檢技術(shù), 可作為孔石莼現(xiàn)場檢測的重要工具并加以推廣。

4 結(jié)論

本研究以孔石莼的rDNA-ITS序列為檢測靶標(biāo)建立了LAMP-LFD方法能夠特異性地應(yīng)用于孔石莼的檢測。該方法檢測時間短, 從核酸擴(kuò)增到LFD結(jié)果展示, 整個檢測過程僅需 60min。該方法具有良好的檢測靈敏度, 最低可檢測到3.04×10–2pg/μL的孔石莼基因組 DNA。由于該技術(shù)從核酸擴(kuò)增開始的整個檢測過程能夠徹底擺脫對于儀器設(shè)備的依賴性, 容易操作上手, 作為一種新型技術(shù), 有望成為我國東部沿?？资豢焖贆z測的有效手段之一。

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