劉 皓 張玉紅 羅 杰 劉楚吾 劉 麗

(廣東海洋大學水產(chǎn)學院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點實驗室 湛江 524025)

紅鰭笛鯛(Lutjanus erythopterus Bloch 1790)隸屬硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鱸形目、笛鯛科、笛鯛屬, 為暖水性近底層魚類, 生存溫度范圍為 2—34°C, 最適生長溫度范圍為 25—30°C, 適應鹽度為 5—40, 最適鹽度為20—30, 分布范圍廣, 在我國主要產(chǎn)于南海和東海南部, 為南海重要經(jīng)濟魚類之一。紅鰭笛鯛個體較大, 生長速度快, 肉質(zhì)豐厚, 含豐富的蛋白質(zhì)和脂肪, 經(jīng)濟效益顯著。近年來, 對紅鰭笛鯛的研究主要集中在繁殖技術(shù)、養(yǎng)殖技術(shù)、生化研究和遺傳學方面的研究(陳武各, 2002; 鄭樂云等, 2004; 彭銀輝等,2008), 有關(guān)紅鰭笛鯛性腺發(fā)育的研究很少, 僅見楊春玲等(2010)用組織學方法對 1.5—2.5齡紅笛鯛(Lutjanus sanguineus)的性腺發(fā)育進行了初步研究。本文對紅鰭笛鯛性腺發(fā)育進行了組織學研究, 以期掌握紅鰭笛鯛性腺發(fā)育的過程及周期變化、各發(fā)育時期生殖細胞的細胞學特點, 了解其繁殖性能, 進一步開發(fā)和保護好這一優(yōu)良種質(zhì)資源, 并且進一步豐富魚類繁殖生物學的內(nèi)容。

1 材料與方法

養(yǎng)殖紅鰭笛鯛性腺發(fā)育材料由湛江?？盗魃碁臭~排提供。1齡以內(nèi), 每1—2個月取材一次; 1齡以上, 每3—6個月取材一次, 每次取材5—10尾。測量體長、體重后, 解剖取出性腺, 用Bouin’s液固定, 參照芮菊生(1980)《組織切片技術(shù)》的方法, 在室溫下作連續(xù)石蠟切片, 切片厚度 6—8μm, 蘇木精-伊紅染色, Leica DM 6000 B攝影生物顯微鏡觀察、攝影。

2 結(jié)果

2.1 卵細胞生長期時相的劃分及特點

根據(jù)紅鰭笛鯛雌性生殖細胞在各個發(fā)育時期的體積大小、內(nèi)含物累積變化等細胞生物學特征, 以及其形態(tài)特征, 參照劉筠(1993)的分期標準, 將其生長發(fā)育過程(包括退化)分為6個時相。

Ⅰ時相(卵原細胞) 由原始生殖細胞分化而來的卵原細胞, 細胞直徑13μm左右, 圓形或橢圓形,以分散(Ⅰ期早期卵巢)或者細胞團(Ⅰ期晚期卵巢)的方式分布在蓄卵板的邊緣, 呈微嗜酸性反應; 細胞核位于細胞中央, 體積較大, 直徑8μm左右, 核質(zhì)比為61%。核切面中央部位一般可見大的核仁1—2個(圖1, 圖 10)。

圖 1 Ⅰ時相(卵原細胞期)(×400)Fig.1 The oogonium in phase Ⅰ(black arrow) (×400)

Ⅱ時相卵母細胞 由卵原細胞分化而來, 屬于初級卵母細胞的小生長期。細胞呈圓形或橢圓形,多角, 細胞質(zhì)呈嗜堿性反應。細胞膜外包圍一層濾泡細胞構(gòu)成的濾泡膜。卵母細胞平均直徑 36μm 左右,胞核直徑平均20μm左右, 核質(zhì)比為55%。細胞核中的核仁數(shù)增多, 多靠近核膜內(nèi)側(cè)分布。也有的Ⅱ時相中期卵母細胞中似乎具有旁核, 但不是普遍現(xiàn)象。

根據(jù)Ⅱ時相卵母細胞和核的直徑, 核仁的數(shù)量、大小及核仁位置的變化、染色的深淺等特征, 可將其發(fā)育分為早、中、晚3個階段。(1) 早期: 剛從卵原細胞分化而來, 體積較小, 染色深, 核仁數(shù)目少(1到多個)而體積大, 多位于核的中央, 一般都有一個體積特別大的核仁(圖2); (2) 中期: 體積較大, 染色深,核仁數(shù)目較多, 一般位于核的邊緣(圖 3); (3) 晚期:體積進一步增大, 細胞質(zhì)嗜堿性反應減弱, 染色變淺,核仁多個(圖3)。

Ⅲ時相卵母細胞 初級卵母細胞進入大生長期, 細胞質(zhì)為弱嗜堿性。體積明顯增大, 細胞直徑203μm左右, 核徑直徑100μm左右, 核質(zhì)比49%。其主要特點是細胞質(zhì)膜外包圍由二層濾泡細胞構(gòu)成的濾泡膜, 外層細胞呈梭形, 有一大的核, 細胞之間的界限不清楚; 濾泡膜和細胞質(zhì)膜之間出現(xiàn)薄層的放射膜(圖 4); 細胞質(zhì)中出現(xiàn)皮質(zhì)液泡并由邊緣逐漸向中央增多, 液泡的數(shù)量和大小隨著卵母細胞的進一步生長發(fā)育而增加; 卵黃顆粒從細胞的邊沿開始累積、不斷增加并向中央擴展。此時, 核仁大部分都分布在核膜的邊緣, 只有少數(shù)分散在核的中央。

圖2 Ⅱ時相早期卵母細胞(白色箭頭)、卵原細胞(黑色箭頭)(×400)Fig.2 The oocyte of the early stage in phaseⅡ (white arrow)and the oogonium in phase Ⅰ(black arrow) (×400)

圖3 Ⅱ時相中期(虛線箭頭)和Ⅱ時相晚期(實線箭頭)卵母細胞(×400)Fig.3 The oocytes of the mid-stage(dotted arrow) and the late stage in phaseⅡ (solid arrow) (×400)

圖4 Ⅲ時相卵母細胞(箭頭)(×400)Fig.4 The oocytes in phase Ⅲ (arrow) (×400)

Ⅳ時相卵母細胞 為初級卵母細胞大生長期的后階段, 即生長成熟階段。細胞體積明顯增大, 細胞直徑平均362μm左右, 核徑平均82μm左右, 核質(zhì)比22%。細胞質(zhì)中卵黃繼續(xù)積累、增加并由細胞的邊緣逐漸向中央擴展, 最終充滿整個細胞, 而且卵黃顆粒不僅數(shù)量增加, 體積也不斷增大而達到最終大小;細胞核從卵中央逐漸移向邊緣, 最終到達動物極一端; 隨著卵母細胞的成熟, 構(gòu)成濾泡膜的兩層濾泡細胞更加明顯, 并且內(nèi)層濾泡細胞變得比外層濾泡細胞圓而大; 放射膜增厚(圖5)。

Ⅵ時相卵母細胞(閉鎖濾泡) 本研究沒有獲得第5期卵巢和產(chǎn)后卵巢, 因此沒有觀察到卵母細胞排出后殘留的濾泡細胞等形成的產(chǎn)后黃體及殘留的退化中的未產(chǎn)出的Ⅳ時相和Ⅴ時相卵母細胞, 但在第Ⅱ期、第Ⅲ期和第Ⅳ期卵巢中都發(fā)現(xiàn)有退化的卵母細胞形成的閉鎖濾泡, 可見卵母細胞的退化是存在于各個發(fā)育時期的普遍現(xiàn)象。閉鎖濾泡的主要特征是:濾泡細胞增多、肥大, 而且排列不規(guī)則; 放射膜不規(guī)則, 局部增厚; 卵黃潰散、液化; 核膜崩解, 細胞核消失或處于消失過程中(圖6)。

圖6 Ⅵ時相(退化中)的卵母細胞(×400)Fig.6 The oocyte in phase Ⅵ (atresic follicle) (×400)

2.2 生長期卵巢的組織學結(jié)構(gòu)

通過顯微鏡檢查, 根據(jù)卵巢中卵細胞不同發(fā)育時相, 以切片視野中數(shù)量占優(yōu)勢或者占面積比例最大的卵細胞類型為依據(jù)將發(fā)育到生長成熟期的卵巢劃分為4期。

Ⅰ期卵巢 Ⅰ期卵巢的形狀早期為透明的細線狀, 晚期為扁平帶狀, 肉眼無法區(qū)分出雌、雄性別。雌魚 4—6月齡時卵巢腔形成, 卵巢已分化完全。卵巢壁主要由上皮細胞和結(jié)締組織構(gòu)成, 在早期(剛分化的Ⅰ期卵巢)蓄卵板尚未形成。卵巢中的生殖細胞主要是第Ⅰ時相卵原細胞, 分散排列在卵巢基質(zhì)中(圖 7)。到比較晚的時期形成一個個的褶皺狀的蓄卵板(圖 8), 蓄卵板的內(nèi)層(靠近卵巢腔一側(cè))主要由較有規(guī)則的、一團團的卵原細胞構(gòu)成, 蓄卵板的中央為卵巢壁外層的結(jié)締組織延伸來的間質(zhì)(圖 9), 卵巢切片的一側(cè)有較大的血管。

Ⅱ期卵巢 8月齡至 25月齡的雌性紅鰭笛鯛的卵巢處于第Ⅱ期, 卵巢長度增加, 體積增大, 外觀呈圓柱狀, 表面可見微血管分布, 呈肉紅色。肉眼大體上可分辨出雌、雄性別, 但肉眼仍難看清卵粒, 固定后卵巢呈現(xiàn)花瓣狀的分葉, 這就是切片上看到的蓄卵板。隨著發(fā)育的進展, 切片中蓄卵板和卵巢腔都比較發(fā)達, 蓄卵板中央間質(zhì)細胞所占空間比例減少(圖11)。Ⅱ期早期的卵巢中主要是Ⅱ時相早期及部分Ⅱ時相中期的卵母細胞。Ⅱ期晚期卵巢中主要是Ⅱ時相晚期和中期的卵母細胞,也有少數(shù)Ⅲ時相的卵母細胞。Ⅱ期卵巢蓄卵板的邊緣存在不少染成淺紅色的卵原細胞。

圖7 第Ⅰ期卵巢早期(×400)Fig.7 The ovary at earlier stage Ⅰ (×400)卵原細胞較少, 分散排列

圖8 第Ⅰ期卵巢晚期(×200)Fig.8 The ovary at later stage Ⅰ (×200)卵原細胞比早期增多, 排列變得有規(guī)律

圖9 Ⅰ期卵巢向Ⅱ期卵巢過渡Fig.9 The ovary transited from stage Ⅰ t o stageⅡ

圖10 圖9的局部放大Fig.10 The close-up of figure 9

圖11 第Ⅱ期卵巢(×50)Fig.11 The ovary at stage (×50Ⅱ)

Ⅲ期卵巢 25月齡以上雌性紅鰭笛鯛的卵巢處于第Ⅲ期, 其體積較Ⅱ期卵巢明顯增大、變圓, 表面有豐富的血管。Ⅲ期卵巢中卵母細胞主要有Ⅲ時相和Ⅱ時相, 也有少量的Ⅳ時相的卵母細胞, 作為卵母細胞來源提供者的卵原細胞總是存在的(圖12)。

Ⅳ期卵巢 2.5—3齡紅鰭笛鯛可達生長成熟,卵巢為Ⅳ期。卵巢為長橢圓形, 淡黃色, 表面血管發(fā)達。卵巢內(nèi)卵細胞明顯, 可見少量透明卵粒。卵巢內(nèi)卵母細胞排列比較松散, 多數(shù)為Ⅳ時相卵母細胞和較多的Ⅲ時相卵母細胞, 也有數(shù)量不少的Ⅱ時相卵母細胞, 但只在蓄卵板的邊緣可見少數(shù)分散分布的卵原細胞(圖5, 圖13)。

圖12 第Ⅲ期卵巢(×50)Fig.12 The ovary at stage Ⅲ (×50)

圖13 第Ⅳ期卵巢(×50)Fig.13 The ovary at stage Ⅳ (×50)

2.3 第一個性周期內(nèi)紅鰭笛鯛卵巢的發(fā)育程序

本研究表明, 4月齡左右紅鰭笛鯛卵巢已分化成形, 達到Ⅰ期卵巢, 卵巢內(nèi)的生殖細胞主要是卵原細胞(圖 7, 圖 8, 圖 9, 圖 10)。8月齡時卵巢中部分卵原細胞分化為第Ⅱ時相早期的卵母細胞, 因此卵巢開始發(fā)育為Ⅱ期(圖11), Ⅱ期卵巢一直維持到24月齡;25月齡紅鰭笛鯛卵巢有部分可發(fā)育到Ⅲ期(圖12), 其中有較多的 Ⅲ時相卵母細胞, 也有少量的Ⅳ時相的卵母細胞(圖 5, 圖 13), 但總體來說, 還是第Ⅲ期卵巢。此后, 隨著生長發(fā)育, 卵巢在內(nèi)、外環(huán)境條件的調(diào)控下進入成熟時期, 2.5—3齡魚的卵巢可達到第Ⅳ期、Ⅴ期的成熟期。

3 討論

3.1 關(guān)于卵巢腔的形成

關(guān)于脊椎動物生殖腺的形成(Gilbert, 2010), 如兩棲類及哺乳類, 先是中腎兩內(nèi)側(cè)腹膜增厚向體腔突出而形成生殖嵴, 原始生殖細胞遷入生殖嵴形成生殖腺, 然后生殖腺背部形成初級生殖腔。它充滿了由間葉細胞形成的網(wǎng)索(原始性索)而成為髓部, 而周圍的上皮和間質(zhì)細胞構(gòu)成皮層。當分化為雌性時, 髓部的網(wǎng)索消失產(chǎn)生許多空腔(次級生殖腔), 彼此連通而成為卵巢腔, 原始生殖細胞從網(wǎng)索遷入皮層而成為卵原細胞。許多研究者通過研究, 結(jié)果認為在不同的魚類, 卵巢腔的形態(tài)、形成的時間和方式各不相同。Nakamura(1978)將卵巢腔形成分成3種方式: 一種是生殖腺分化時, 其外側(cè)面上下各形成一個組織突, 兩個突起相對延伸、融合而形成卵巢腔, 如銀漢魚(Odontesthes bonariensis)等(Strüssmann et al, 1996);第二種是腹膜壁在連接性腺的地方有一小團細胞逐漸延伸, 與已形成的生殖腺的邊緣融合而形成卵巢腔,如 C. auratus及其它一些鯉科魚類(Nakamura, 1978);另一種是性腺向體腔后面延伸, 與體腔后壁融合而形成卵巢腔, 鳉如青(Oryzias latipes) (Nakamura,1978)。但游秀容等(2012)對大黃魚卵巢腔形成方式的研究結(jié)果與這 3 種方式都有區(qū)別, 是由卵巢腹部微血管旁的性腺組織向背方生長, 而卵巢柄狀背部的體細胞增殖并向腹面生長, 二者融合而形成卵巢腔。本文從紅鰭笛鯛較早期卵巢的組織學結(jié)構(gòu)來看(圖9),其卵巢腔的形成似乎類似于大黃魚卵巢腔的形成方式, 由卵巢兩端延伸、融合而形成。

3.2 關(guān)于雌性生殖細胞各時相名稱及其與內(nèi)容的統(tǒng)一

關(guān)于魚類性腺發(fā)育分期, 國際上沒有一個統(tǒng)一的標準(瑔施芳, 1988; 劉筠, 1993; 張賢芳等, 2006;代明山等, 2009)。最早對硬骨魚雌性生殖細胞進行分期的應是前蘇聯(lián)學者B.A.Meйeн, 他將魚類卵母細胞的生長期分為胞核改變期、小生長期和大生長期三個時期。然而, 這個分期方法既不系統(tǒng), 也不全面, 例如, 他對胞核改變期的描述包括細線期、偶線期、粗線期、雙線期等, 實際上這是減數(shù)分裂前期染色體演變的四個階段。但這種染色體演變程序不一定就只局限于他所指的稚齡時相之前的胞核改變期。另外, 該分期方法中也沒有包括卵原細胞期。在科研和生產(chǎn)應用中, 我國科技工作者, 在Meйeн的分期方法的基礎上不斷加以改進和完善, 根據(jù)硬骨魚卵巢的組織學特征, 現(xiàn)已基本上統(tǒng)一將其分為6期, 根據(jù)卵細胞的細胞學特征, 將其生長發(fā)育過程分為6個時相, 其方法、內(nèi)容和名稱日趨一致(徐亞飛等, 2015), 但是仍不是很統(tǒng)一, 有的把時相的劃分與卵巢的分期基本能對應起來, 有的不能對應, 例如, 大多將第Ⅰ時相的定義為卵原細胞期(有的包括由卵原細胞向初級卵母細胞過渡的階段), 有的將第Ⅰ時相定義為由卵原細胞向初級卵母細胞過渡的細胞構(gòu)成(孫鵬等, 2013);有的雖然將卵原細胞劃分為第Ⅰ時相, 而在對卵巢進行分期時, 又沒有包括卵原細胞; 還有, 對第Ⅰ時相的名字和內(nèi)容也有不一致的地方或者文字與圖不一致, 例如有的稱為第Ⅰ時相卵母細胞, 但其描述又是卵原細胞期(曹伏君等, 2010; 馬世磊等, 2014; 曲煥韜等, 2015; 李培倫等, 2015)。本文作者認為, 經(jīng)過如此長時間的研究和應用, 現(xiàn)在應該可以形成一致的概念了, 根據(jù)大多數(shù)人的提法, 可將第Ⅰ時相的定義為卵原細胞期, 第Ⅰ期卵巢主要由卵原細胞和少數(shù)剛向初級卵母細胞分化的細胞組成; 卵原細胞一旦不再進行有絲分裂而進行分化, 便進入初級卵母細胞的早期階段, 因此可以定義為第Ⅱ時相卵母細胞。

3.3 紅鰭笛鯛的性成熟與產(chǎn)卵類型

在對性腺發(fā)育研究的基礎上, 學者們將硬骨魚類的產(chǎn)卵類型分為一次性產(chǎn)卵和多次性產(chǎn)卵。一次產(chǎn)卵類型, 是指一年一度產(chǎn)卵一次, 如四大家魚, 其卵母細胞生長發(fā)育的特點主要是: 從Ⅲ時相至Ⅳ時相是基本上是同步的, 全產(chǎn)后的卵巢處于第Ⅱ期, 沒有或很少有次發(fā)性的Ⅲ時相和Ⅳ時相卵母細胞, 在一年之內(nèi), 卵巢成熟系數(shù)只在繁殖季節(jié)出現(xiàn)一次高峰(劉筠, 1993)。多次產(chǎn)卵類型則是在一年之內(nèi)可以產(chǎn)卵多次, 如尼羅羅非魚, 其卵母細胞和卵巢在生長發(fā)育過程中的主要特點是:由Ⅲ時相發(fā)育到Ⅳ時相是非同步性的, 在繁殖季節(jié), 第Ⅳ期卵巢中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時相卵母細胞同時存在, 并且Ⅳ+、Ⅳ++、Ⅳ+++同時存在, 產(chǎn)卵后的卵巢組織學結(jié)構(gòu)仍然是Ⅳ期, 在一年內(nèi)卵巢成熟系數(shù)明顯地形成多次波峰和波谷(劉筠等,1983)。但不同研究者對同一種魚產(chǎn)卵類型的研究曾獲得了不同的結(jié)果, 如有些研究者認為草魚是一次性產(chǎn)卵類型(劉筠等, 1978), 而有的研究者則認為是多次產(chǎn)卵類型(林光華等, 1985)。這可能與環(huán)境因素的影響及飼養(yǎng)條件有關(guān)(中山大學生物系動物學教研室等, 1978; 瑔施芳, 1992; 林浩然, 1999)。在本研究的取材過程中發(fā)現(xiàn), 魚的性成熟年齡和產(chǎn)卵類型可能確與環(huán)境及飼養(yǎng)條件相關(guān), 例如, 在海南省南部紅鰭笛鯛從3月到12月都可以產(chǎn)卵, 作者在6月和12月分別在海南省三亞市紅沙龍勝魚苗場和海南三亞蜈支洲島魚苗場現(xiàn)場進行了早期胚胎發(fā)育的活體觀察, 而與海南只瓊州海峽之隔的湛江, 紅鰭笛鯛在秋冬季不能進行繁殖, 說明環(huán)境因素對其性成熟和產(chǎn)卵的影響很大; 同時, 從本研究的性腺發(fā)育取材來看,10月齡的魚的個體(平均體重678.3g)比8月齡的個體(平均體重 778.3g), 前者的卵巢剛開始從Ⅰ期卵巢向Ⅱ期卵巢分化, 只有極少數(shù)Ⅱ時相的卵母細胞, 而后者的卵巢內(nèi)已有較多的Ⅱ時相的卵母細胞, 其發(fā)育比 10月齡的要快, 也說明不同養(yǎng)殖條件下會對性成熟產(chǎn)生影響。

也有很多學者將卵巢發(fā)育分為完全同步型、部分同步型(分批同步型)和不同步型(分批非同步型)(施瑔芳, 1988; 林浩然, 1999; 張賢芳等, 2006)。作者認為這種劃分實際上是對一次產(chǎn)卵和多次產(chǎn)卵類型提法的補充和完善, 特別是分批同步型(部分同步型)能夠解釋同種魚在不同環(huán)境條件下在一年內(nèi)一次產(chǎn)卵或多次產(chǎn)卵。完全同步型是指卵巢內(nèi)卵母細胞處于相同的發(fā)育階段或者卵子發(fā)育基本同步, 成熟系數(shù)每年只出現(xiàn)一次高峰期, 比如南方鲇(張耀光等, 1996)、大彈涂魚(蔡澤平, 1994)以及前述的四大家魚等, 實際應是屬一次性產(chǎn)卵, 鳠而斑在人工馴養(yǎng)條件下卵巢發(fā)育為非同步型, 但其產(chǎn)卵類型仍為為一次產(chǎn)卵類型, 其產(chǎn)卵結(jié)束后, 卵巢中雖然仍存在大量的Ⅲ期、Ⅳ期卵母細胞, 但發(fā)育到Ⅴ期需要較長的時間和大量的營養(yǎng)積累, 鳠斑一次產(chǎn)卵結(jié)束后, 需要攝取大量的營養(yǎng)物質(zhì), 為下一年產(chǎn)卵做準備(謝少林等,2014)。部分同步型的卵巢一年只成熟一次, 但斷續(xù)進行幾次產(chǎn)卵, 產(chǎn)卵時間有一定的間隔, 如納木錯裸鯉(何德奎等, 2001)等; 人工養(yǎng)殖半滑舌鰨(陳彩芳等,2010)、圓斑星鰈(徐永江等, 2011)等, 也是 1年中只有1個繁殖期(1次成熟), GSI在一年的產(chǎn)卵期內(nèi)僅出現(xiàn)一個峰值區(qū), 也應屬于分批同步型。分批非同步型可連續(xù)多次產(chǎn)卵, 比如革胡子鲇(林光華等, 1995)、旗魚(Arocha, 2002)、羅非魚(劉筠等, 1983)等, 屬于典型的多次產(chǎn)卵類型。

本文從紅鰭笛鯛第Ⅳ期卵巢中存在各個不同發(fā)育等級的生殖細胞來看, 符合分批非同步型性腺的特征, 在生產(chǎn)實踐中, 一年也能進行多次繁殖, 因此,紅鰭笛鯛應是屬于多次產(chǎn)卵類型, 當然紅鰭笛鯛的產(chǎn)卵類型究竟是屬于分批同步型(部分同步型)還是分批非同步型(不同步型)的準確結(jié)論還是要通過性成熟后性腺的周年變化情況的研究才能得到。

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