郝杰華 許 強(qiáng)① 汝少國 楊紅生

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 青島 266003; 2. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

櫛孔扇貝(Chlamys farreri)和蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)是我國近海重要的養(yǎng)殖貝類。近年來, 全球氣溫的變化和海水溫度異常波動(dòng)對近海扇貝的不利影響日趨嚴(yán)重(高菲, 2005)。掌握不同溫度下扇貝的血液循環(huán)生理特征, 是揭示扇貝生理代謝機(jī)能變化的有效途徑, 也是制訂應(yīng)對策略、優(yōu)化養(yǎng)殖管理的必然需求。循環(huán)系統(tǒng)生理學(xué)是動(dòng)物生理學(xué)重要組成部分, 主要研究動(dòng)物心臟、血管的生理特征、活動(dòng)規(guī)律及其影響因素等, 研究的指標(biāo)主要包括心率、血管收縮舒張?zhí)卣鳌⒀鲃?dòng)態(tài)(流向、流速、流量、阻力)等(楊秀平等, 2002)。能反映心血管機(jī)能的循環(huán)系統(tǒng)生理學(xué)指標(biāo)是指示新陳代謝水平和機(jī)體機(jī)能狀態(tài)的有效參數(shù)(Trueman, 1967; Campbell et al, 2007)。但是由于缺乏適用的技術(shù), 貝類血液循環(huán)生理的研究遲遲無法開展, 國外也僅對貽貝、腹足類等心率指標(biāo)的生理節(jié)律變化開展研究(Bakhmet et al, 2006; Braby et al,2006; Kholodkevich et al, 2009; Burnett et al, 2013),對其它循環(huán)生理功能的研究尚不多見。

多普勒超聲成像技術(shù)是高等動(dòng)物循環(huán)生理學(xué)研究的核心技術(shù)之一, 可清晰呈現(xiàn)組織器官內(nèi)部的血流信息, 包括血流方向、速度、加速度等, 從而實(shí)現(xiàn)血流狀態(tài)的無損實(shí)時(shí)監(jiān)測(Braby et al, 2006; Novelo et al, 2012)。近年來, 該技術(shù)正逐步應(yīng)用于魚類、兩棲類和其它水生動(dòng)物的循環(huán)生理研究, 但超聲成像技術(shù)在雙殼貝類研究中的應(yīng)用還很少, 僅見于Haefner等(1996)針對貽貝的研究, 闡述了不同溫度下貽貝心率和血流速度的變化特征。

本研究將多普勒超聲成像技術(shù)引入貝類循環(huán)生理研究中, 選取我國北方重要的扇貝種類——櫛孔扇貝和蝦夷扇貝, 解析并量化了不同溫度下兩種扇貝循環(huán)生理指標(biāo)特征, 以期揭示兩種不同適溫性的扇貝在循環(huán)生理功能方面的適應(yīng)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1齡櫛孔扇貝(C.farreri)和蝦夷扇貝(P.yessoensis)分別在青島膠州灣筏式養(yǎng)殖區(qū)和大連獐子島底播養(yǎng)殖區(qū)獲得。清除扇貝表面的污物及附著生物, 控溫水箱內(nèi)暫養(yǎng)兩周, 暫養(yǎng)期間溫度為(10±1)°C; 鹽度為31.3。每天上午10點(diǎn)全量換水1次, 并定量投喂小球藻(Chlorellasp.)、金藻(Chrysophytasp.)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)。馴養(yǎng)1周后, 櫛孔扇貝和蝦夷扇貝分別隨機(jī)挑選 6—10只健康及規(guī)格相近的個(gè)體用于實(shí)驗(yàn)(見表1)。

表1 櫛孔扇貝和蝦夷扇貝基礎(chǔ)生物學(xué)指標(biāo)Tab.1 Basic biological indices of C. farreri and P. yessoensis

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溫度處理 實(shí)驗(yàn)設(shè)置10、15、20和25°C 4個(gè)溫度梯度, 從 10oC緩慢逐步加溫(2°C/d)達(dá)到設(shè)定溫度, 到既定溫度后保持1h, 使扇貝處于相對穩(wěn)定的狀態(tài), 然后測定血液循環(huán)生理學(xué)指標(biāo)。采用控溫水族箱水浴控制溫度, 誤差為±0.5°C。

1.2.2 儀器設(shè)備 實(shí)驗(yàn)所用儀器為Z6 Vet型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀(中國深圳 Mindray公司),探頭頻率為8—14MHz。

1.2.3 測定方法 在測定扇貝時(shí), 用萬向支架固定超聲探頭, 使探頭沒入水中且可自由調(diào)節(jié)探頭方向; 用塑料夾固定扇貝于塑料水族箱底, 待其自然張口后調(diào)節(jié)探頭的聲波切面與扇貝貝殼面平行, 微調(diào)探頭方向, 使超聲面切過扇貝出鰓血管, 此時(shí)儀器顯示屏上出現(xiàn)扇貝血流的穩(wěn)定圖像, 穩(wěn)定30s后保存至少1min的動(dòng)態(tài)錄像待后續(xù)分析。

1.2.4 彩超圖像 在多普勒彩超模式下保存的扇貝血管彩超圖和心率波動(dòng)圖, 見圖 1。圖中不同顏色的血管代表不同的流動(dòng)方向, 其中藍(lán)色代表入鰓血管, 紅色代表出鰓血管; 在心率波動(dòng)曲線中, 每個(gè)周期代表一次心臟的收縮過程, 波動(dòng)的高低代表血管中血液的瞬時(shí)流速, 波峰處為其最大瞬時(shí)流速; 其中“62/170”表示在該分析錄像時(shí)長共 170s, 圖像停留在62s處, 左側(cè)縱坐標(biāo)表示套頭的位置, 右側(cè)縱坐標(biāo)表示血流速度和方向。

圖1 多普勒彩超模式下扇貝血管的彩超圖和心率波動(dòng)圖Fig.1 The Doppler color picture showing scallop vascular and heart rate fluctuation

1.2.5 指標(biāo)體系 實(shí)驗(yàn)扇貝的血流指標(biāo)、計(jì)算方法及其循環(huán)生理學(xué)意義指征如下:

(1) 心率(Heart Rate, HR, 次/min)

每分鐘的心動(dòng)周期即為扇貝的心率(HR), 心率的大小能反映心臟的泵血能力。

(2) 收縮峰值速度(Peak Systolic Velocity, PS,cm/s)

代表所測量血管內(nèi)血液瞬時(shí)峰值流速。

(3) 舒張末期速度(End-Diastolic Velocity, ED,cm/s)

代表所測量血管內(nèi)血液最低瞬時(shí)速度。

(4) 血流加速度(Acceleration of Blood Flow,ABF, cm/s2)

單位時(shí)間內(nèi)血流速度的提升率, 即 ABF=(PSED)/t, 能反映血流速度變化快慢和心臟的泵血機(jī)能。

(5) 血液最大瞬時(shí)流量(Maximum Instantaneous Blood Flow, Max-IBF, mL/s)

Max-IBF表示扇貝血流收縮峰值速度對應(yīng)的血管的瞬時(shí)最大血流量, 與血管的直徑和血液流速相關(guān)。

(6) 血液最小瞬時(shí)流量(Minimum Instantaneous Blood Flow, Min-IBF, mL/s)

Min-IBF表示扇貝血流舒張末期速度對應(yīng)的血管的瞬時(shí)最小血流量, 與血管的直徑和血液流速相關(guān)。

(7) 阻力指數(shù)(Resistive Index, RI)

阻力指數(shù)的意義為RI=(PS-ED)/PS, 其值的大小可以用來判斷血液或血管的機(jī)能是否異常。

(8) S/D

S/D表示血管收縮峰值速度與血管舒張末期速度的比值, 即S/D=PS/ED; 其值的大小可以用來判斷扇貝的血管是否受到損傷。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析, 顯著性差異定義為 P＜0.05, 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。同時(shí)分別對不同扇貝基礎(chǔ)循環(huán)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝HR的影響

溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝 HR的影響總體相似。櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的HR與溫度正相關(guān), 且溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 HR均影響顯著(圖 2,P＜0.05)。在同一溫度下, 櫛孔扇貝的HR大于蝦夷扇貝; 在 10—25°C之間, 櫛孔扇貝變化范圍為 16—39次/min, 蝦夷扇貝變化范圍為 14—31次/min。在10—20°C范圍內(nèi)相鄰兩個(gè)溫度設(shè)置下, 櫛孔扇貝HR有顯著差異(P＜0.05), 20°C與最高溫25°C無顯著差異(P＞0.05); 在 15—25°C 范圍內(nèi)相鄰兩個(gè)溫度設(shè)置下,蝦夷扇貝 HR 有顯著差異(P＜0.05), 15°C 與最低溫10°C 無顯著差異(P＞0.05)。

圖2 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的心率Fig.2 The HR of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

2.2 溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝ABF的比較

櫛孔扇貝和蝦夷扇貝 ABF與溫度呈正相關(guān), 且溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝 ABF均影響顯著(圖 3,P＜0.05)。櫛孔扇貝 ABF整體大于蝦夷扇貝; 在10—25°C內(nèi), 櫛孔扇貝變化范圍為1.75—15.84cm/s2,蝦夷扇貝變化范圍為 0.99—7.41cm/s2(P＜0.05)。櫛孔扇貝在15—25°C范圍內(nèi), 相鄰兩個(gè)溫度設(shè)置下ABF無顯著差異(P＞0.05), 與最低溫 10°C 差異顯著(P＜0.05); 蝦夷扇貝則在10—20°C范圍內(nèi), 相鄰兩個(gè)溫度設(shè)置下 ABF無顯著差異(P＞0.05), 與最高溫25°C 差異顯著(P＜0.05)。

圖3 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的ABFFig.3 The ABF of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

2.3 溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝血管PS及ED的影響

櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的PS值隨溫度的增加呈上升趨勢(見圖4)。在同一實(shí)驗(yàn)溫度下, 櫛孔扇貝的PS大于蝦夷扇貝; 在 10—25°C 內(nèi), 櫛孔扇貝變化范圍為 3.54—8.09cm/s, 蝦夷扇貝變化范圍為 2.32—8.85cm/s。櫛孔扇貝在 10—20、15—25°C 內(nèi), 相鄰兩個(gè)溫度設(shè)置下PS無顯著差異(P＞0.05), 20°C與最低溫10°C 差異顯著(P＜0.05); 蝦夷扇貝則在 10—20°C 范圍內(nèi), 相鄰兩個(gè)溫度設(shè)置下 PS有顯著差異(P＜0.05),20oC與最高溫25°C無顯著差異(P＞0.05)。

溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 ED影響不明顯(見圖 5)。在 10—25°C 內(nèi), 櫛孔扇貝變化范圍為1.51—3.15cm/s, 蝦夷扇貝變化范圍為1.09—4.23cm/s。櫛孔扇貝在10—20°C內(nèi), 相鄰兩個(gè)溫度設(shè)置下ED無顯著差異(P＞0.05), 20°C 和 25°C 與最低溫 10°C 差異顯著(P＜0.05); 蝦夷扇貝則在10—20°C內(nèi), 相鄰兩個(gè)溫度設(shè)置下ED無顯著差異(P＞0.05), 20°C和25°C與最低溫 10°C 差異顯著(P＜0.05)。

2.4 溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝瞬時(shí)血流量的影響

圖4 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝血管的PSFig.4 The PS of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

圖5 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝血管的ED的比較Fig.5 The ED of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 Max-IBF隨溫度升高呈增加的趨勢(見圖6); 同一溫度下, 蝦夷扇貝的Max-IBF大于櫛孔扇貝。在實(shí)驗(yàn)溫度梯度內(nèi)櫛孔扇貝的Max-IBF, 在10°C下最小值為0.098mL/s, 25oC下的最大值為 0.210mL/s, 20°C、25°C 與 10°C 間差異顯著(P＜0.05)。蝦夷扇貝在實(shí)驗(yàn)溫度梯度內(nèi), 10°C下的最小值為0.226mL/s, 20°C下出現(xiàn)峰值0.297mL/s, 25°C又略呈下降趨勢, 實(shí)驗(yàn)溫度梯度范圍內(nèi)血流量差異不顯著(P＞0.05)。

櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 Min-IBF變化趨勢與最大瞬時(shí)趨勢相近(見圖 7)。在實(shí)驗(yàn)溫度內(nèi), 櫛孔扇貝在 10°C 下為其最小值, 25°C 為其最大值, 分別為0.047、0.071mL/s, 且溫度范圍內(nèi)血流量差異不顯著(P＞0.05)。櫛孔扇貝在 10°C 下為其最小值, 25°C 為其最大值, 分別為 0.084、0.133mL/s, 且溫度范圍內(nèi)血流量差異不顯著(P＞0.05)。

2.5 溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝RI及S/D的影響

圖6 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的Max-IBFFig.6 The Max-IBF of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

圖7 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的Min-IBFFig.7 The Min-IBF of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的RI影響不明顯(圖8,P＞0.05); 在10—25°C內(nèi), 櫛孔扇貝RI變化范圍為0.49—0.69, 蝦夷扇貝 RI變化范圍為0.42—0.54。櫛孔扇貝在4個(gè)溫度點(diǎn)的RI無顯著的差異(P＞0.05); 在蝦夷扇貝中, RI整體差異不大, 但15°C與20°C之間的RI具有顯著性差異(P＜0.05)。

溫度對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 S/D影響不明顯(圖9,P＞0.05), 10—25°C內(nèi), 櫛孔扇貝S/D變化范圍為2.28—2.83, 蝦夷扇貝S/D變化范圍為1.75—2.12。櫛孔扇貝在4個(gè)溫度點(diǎn)的S/D無顯著的差異(P＞0.05);在蝦夷扇貝中, S/D 整體差異不大(P＞0.05), 但 15°C與20°C之間的S/D具有顯著性差異(P＜0.05)。

2.6 櫛孔扇貝和蝦夷扇貝生理指標(biāo)相關(guān)性對比分析

對四種基礎(chǔ)生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), 兩種扇貝存在十分相近的規(guī)律。心率與血流加速度、收縮峰值血流速度均呈顯著正相關(guān), 即心率越快, 血流加速度越大, 收縮峰值血流速度越高。血流加速度與收縮峰值血流速度呈極顯著正相關(guān), 即血流加速度越大, 收縮峰值血流速度越高(表2, 表3)。

圖8 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的RIFig.8 The RI of C. farreri and P. yessoensis in different temperatures

圖9 不同溫度下櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的S/DFig.9 The S/D of C. farreri and P. yessoensis in differenttemperatures

表2 櫛孔扇貝循環(huán)生理指標(biāo)相關(guān)性分析Tab.2 Correlation result of the circulatory physiological index of C. farreri

表3 蝦夷扇貝循環(huán)生理指標(biāo)相關(guān)性分析Tab.3 Correlation result of the circulatory physiological index of P. yessoensis

3 討論

3.1 多普勒超聲成像技術(shù)的應(yīng)用

反映心血管機(jī)能的循環(huán)系統(tǒng)生理學(xué)指標(biāo)可有效地指示生物新陳代謝水平和機(jī)體機(jī)能狀態(tài)。但是受監(jiān)測技術(shù)的限制, 以往對貝類循環(huán)生理指標(biāo)的研究僅限于心率, 研究方法多采用呼吸描記法(Trueman,1967; Brabyetal, 2006)、體積描記法(Dietzetal, 1980)和直接觀察法(Harrison, 1977a, b), 其缺點(diǎn)是只能間接測定, 且需要破壞貝殼結(jié)構(gòu), 會(huì)對測定指標(biāo)產(chǎn)生影響。本研究創(chuàng)新引入醫(yī)用多普勒超聲成像技術(shù), 準(zhǔn)確測量了扇貝心臟搏動(dòng)特征、血液動(dòng)力學(xué)以及血管機(jī)能等多個(gè)指標(biāo), 該技術(shù)對待測生物無創(chuàng)傷, 可重復(fù)連續(xù)獲得血流生理數(shù)據(jù), 具有安全、方便等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)的應(yīng)用大大方便了貝類循環(huán)生理學(xué)的研究, 為下一步雙殼貝類的循環(huán)生理學(xué)研究開辟了新出路。

3.2 溫度變化對兩種扇貝心臟機(jī)能和血流動(dòng)力學(xué)特征的影響

扇貝心率的高低能反映出扇貝心臟的泵血能力,本實(shí)驗(yàn)中扇貝的心率與實(shí)驗(yàn)溫度呈正相關(guān), 這與其它雙殼貝類(紫貽貝、河蚌、紫踵劈蚌)的研究結(jié)果一致(Nicholson, 2002; Pandolfoetal, 2009)。心率的高低與兒茶酚胺類激素的調(diào)控密切相關(guān)。溫度升高可以顯著提高櫛孔扇貝和牡蠣血淋巴中兒茶酚胺的含量(Lacosteetal, 2001a, b; Chenetal, 2008), 兒茶酚胺通過兒茶酚胺-β受體-cAMP系統(tǒng)刺激心臟, 可刺激心肌細(xì)胞, 使心率加快, 收縮力增強(qiáng), 傳導(dǎo)速度增快,心輸出量增加(Schlaichetal, 2005) 。該現(xiàn)象也已在魚類、蟹類等其它生物的研究中得以證實(shí), Campbell等(2007)研究結(jié)果表明魚類心率提高能直接導(dǎo)致單位時(shí)間的心輸出量增加, 血液循環(huán)速度加快, 使魚類可應(yīng)對較高的機(jī)體代謝水平。De Wachter等(1996)在研究不同溫度對螃蟹心率、每搏輸出量、動(dòng)脈血管的流量中發(fā)現(xiàn), 當(dāng)溫度從12°C升至20°C時(shí), 心率、每搏輸出量、動(dòng)脈血管的流量顯著增加。

與扇貝心率提升對應(yīng)的是動(dòng)脈血液加速度提高,繼而血液循環(huán)速率提升。相對于血流加速度的顯著增加, 在 15—25°C之間, 櫛孔扇貝 PS、ED、Max-IBF和Min-IBF均基本保持穩(wěn)定, 表明盡管血液輸送總量增加, 但仍保持相對穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)狀態(tài); 蝦夷扇貝在該溫度段內(nèi)血液動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定狀況相對較差, 收縮期峰值血流速度僅在 20—25°C下保持穩(wěn)定, 舒張期血流速率在 25°C時(shí)已有顯著升高, 最高血流量也出現(xiàn)下降趨勢, 表明其血液動(dòng)力學(xué)已出現(xiàn)異常跡象, 扇貝機(jī)體可能已進(jìn)入高溫脅迫應(yīng)激狀態(tài)。

3.3 溫度變化對兩種扇貝血管機(jī)能的影響

RI指標(biāo)能反映血管某一橫斷面血流彈性阻力狀態(tài), 可以對血管機(jī)能和是否出現(xiàn)異常進(jìn)行定量評價(jià),當(dāng)血液或血管機(jī)能異常時(shí), 血管阻力增加, 舒張期血流減少, RI值增大; 當(dāng)RI值增大至0.8以上時(shí), 可以斷定血液或血管已受到損害(胡慶鷹等, 2009)。S/D值已廣泛應(yīng)用于胎兒動(dòng)脈狀態(tài)的監(jiān)測, 當(dāng) S/D≥3時(shí),表明臍動(dòng)脈血管出現(xiàn)異常(劉瑛等, 2005; 李仲瑞等,2012)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的 RI和 S/D值隨著溫度的升高而增大, 但變動(dòng)范圍較小,RI值在0.6以下, 變動(dòng)范圍0.1以內(nèi), S/D值變動(dòng)范圍在0.3—0.5, 結(jié)合其它循環(huán)生理指標(biāo)可確定測得的RI和S/D值應(yīng)處于扇貝的正常范圍內(nèi), 扇貝血管沒有器質(zhì)性損傷, 血液循環(huán)機(jī)能正常。但指示扇貝血管出現(xiàn)異常的RI和S/D閾值是多少、脊椎動(dòng)物的正常值范圍是否適用于扇貝還需要開展進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行界定。

4 結(jié)論

一般來說, 生活在寒冷區(qū)域的無脊椎動(dòng)物其新陳代謝速率較溫暖區(qū)域的偏低, 其生態(tài)學(xué)意義是最大程度減少身體的能量損耗, 有助于其適應(yīng)低溫環(huán)境。櫛孔扇貝為暖溫型種類, 主要分布于我國黃渤海到東海沿岸以及日本(北海道)以南和朝鮮沿海(王禎瑞, 2002a), 適溫范圍為4—26°C, 20°C左右為其最適生長溫度(王玲玲, 2006); 蝦夷扇貝則為典型的冷水性種類, 自然分布區(qū)較櫛孔扇貝更偏北, 主要分布在我國黃海北部和日本北部沿海、俄羅斯遠(yuǎn)東海及朝鮮半島海域(王禎瑞, 2002b), 適溫范圍為 0—25°C,15°C為其最適生長溫度(常亞青等, 2007)。兩種扇貝的耐溫性在循環(huán)系統(tǒng)生理特征上明顯體現(xiàn)。蝦夷扇貝HR、ABF和 PS均低于櫛孔扇貝, 而 Max-IBF和Min-IBF均高于櫛孔扇貝, 蝦夷扇貝的血流阻力也要低于櫛孔扇貝, 表明蝦夷扇貝在較低的心臟和血流搏動(dòng)節(jié)律下保持了高效的血液流通, 從而以相對較少的能量消耗維持了其機(jī)體代謝對血液循環(huán)的需求,這也與其冷水性的生態(tài)習(xí)性相適應(yīng)。

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