王祖忠 王朝陽(yáng) 張迪駿 司開(kāi)學(xué) 董麗莎 張紅燕 崔晨茜 韓姣姣 周 君 蘇秀榕

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211)

弓形桿菌(Arcobacter. sp)又稱(chēng)為類(lèi)彎曲菌(Campylobacter-like), 與類(lèi)彎曲菌形態(tài)相似, 親緣關(guān)系很近, 呈彎曲或螺旋形桿狀, 不產(chǎn)芽孢, 最佳生長(zhǎng)氧氣濃度為微量氧氣(3%—10%), 正常大氣氧濃度條件和厭氧條件下也可以生長(zhǎng)。目前已發(fā)現(xiàn) Arcobacter有15個(gè)種, 其中有9種分離自環(huán)境中, 例如, 四聯(lián)球弓形桿菌(Arcobacter halophilus)、埃利斯弓形桿菌(A.ellis)和硝化弓形桿菌(A. nitrofigilis)等(Levican et al,2013)。弓形桿菌屬最高生長(zhǎng)溫度為40°C, 被認(rèn)為最低生長(zhǎng)溫度為15°C, 最佳生長(zhǎng)溫度為25—30°C (Houf et al, 2007; 游淑珠等, 2011)。弓形桿菌屬主要分離于豬肉、牛肉、禽肉等動(dòng)物和水體中, 是一種人畜共患病的食源性和水源性病原菌, 與人類(lèi)胃腸炎和菌血癥有關(guān)。

梭菌屬是能形成芽孢、厭氧生長(zhǎng)的革蘭氏染色陽(yáng)性大桿菌。通常多形態(tài), 以周生鞭毛運(yùn)動(dòng), 芽孢橢圓或球形孢囊膨大。大多數(shù)為化能異養(yǎng)菌, 有的是化能自養(yǎng)菌或無(wú)機(jī)化能異養(yǎng)菌?？梢苑纸馓恰⒌鞍踪|(zhì), 通?？梢援a(chǎn)生混合的有機(jī)酸和醇類(lèi), 不還原硫酸鹽。它們的代謝物極富多樣性, 廣泛分布在環(huán)境中, 許多種可產(chǎn)生外毒素危害人類(lèi)和牲畜生命健康。例如破傷風(fēng)梭菌, 一般通過(guò)深部創(chuàng)傷感染, 產(chǎn)生痙攣毒素, 引起破傷風(fēng)(Sheffield et al, 2004); 肉毒梭菌, 容易在魚(yú)貝類(lèi)腸道、腮和內(nèi)臟中生長(zhǎng), 在適宜條件下能產(chǎn)生肉毒毒素, 人進(jìn)食這些含毒素食品后, 即發(fā)生肉毒中毒。弓形桿菌屬和梭菌屬作為危害人類(lèi)身體健康的病原菌, 一直是研究熱點(diǎn)問(wèn)題之一, 但目前主要集中在水體和食品方面, 陸源排污口中的弓形桿菌屬和梭菌屬未見(jiàn)報(bào)道。本文選取寧波沿海10個(gè)主要的陸源排污口 20個(gè)站位的水樣進(jìn)行分析, 研究陸源排污口弓形桿菌屬和梭菌屬生物種類(lèi)和分布特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別于2011年3月、5月、8月、10月, 在寧波沿海 5個(gè)工業(yè)型排污口(S1象山爵溪東塘排污口,S3象山石浦水產(chǎn)加工園區(qū)排污口, S4象山西周工業(yè)園區(qū)排污口, S5象山墻頭綜合排污口, S7寧海西店崔家綜合排污口, S10余姚黃家埠排污口), 3個(gè)排污河型排污口(S6北侖三山排污口, S8奉化下陳排污口,S9寧海顏公河入海排污口)和1個(gè)市政型排污口(S2象山水桶岱垃圾場(chǎng)排污口)以及距離排污口 50m 以外的 10個(gè)站位點(diǎn)處采集表面水層(圖 1), 采用微生物采水器, 每次采集 4L水樣, 注入無(wú)菌采樣瓶中,4°C下保存。

圖1 陸源排污口的名稱(chēng)和地理位置Fig.1 The name and location of the land-based sewage outfall

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取采集的排污口的海水用0.22μm 的微孔濾膜富集微生物, 利用試劑盒提取基因組 DNA(美國(guó)Omega生物技術(shù)公司)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)細(xì)菌16S rRNA的保守序列,利用 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物： 16SF (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3′)和16SR (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG-3′)。

20μL 擴(kuò)增反應(yīng)體系： 2μL 10×buffer, 2μL MgCl2,2μL dNTP, 上游引物和下游引物各 25μL, 0.2μL Taq DNA聚合酶和1μL DNA模版。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(張迪駿等, 2013; 陳麗萍等,2013)。

PCR擴(kuò)增條件： 94°C預(yù)變性4min, 94°C變性30s,退火溫度從65°C到55°C, 退火30s, 20個(gè)循環(huán); 72°C延伸30s, 94°C變性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸30s, 35個(gè)循環(huán); 最終72°C延伸10min(劉兵等, 2009)。

1.2.3 測(cè)序與分析 將純化后的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行454焦磷酸測(cè)序(王中華等, 2014; Wang et al, 2014),結(jié)果用羅氏軟件2.5.3進(jìn)行信號(hào)處理分析。根據(jù)細(xì)菌在文庫(kù)中出現(xiàn)的頻次數(shù)量, 進(jìn)一步用 R For Window 2.15.2、SPSS等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 排污口中弓形桿菌屬和梭菌屬的種類(lèi)

通過(guò)454高通量測(cè)序的結(jié)果分析, 共檢測(cè)出弓形桿菌屬 2個(gè)種, 分別是嗜低溫弓形桿菌(A.cryaerophilus)、布氏弓形桿菌(A. butzleri); 梭菌屬12個(gè)種, 分別是產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、丁酸梭菌(C. butyricum)、多枝梭菌(C. ramosum)、嗜纖維桿菌(C. cellulovorans)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、熱纖維梭菌(C. thermocellum)、破傷風(fēng)梭菌(C. tetani)雙酶梭菌(C. bifermentans)、類(lèi)腐敗梭菌(C. paraputrificum)、近端梭菌(C. subterminale)、巴氏梭菌(C. pasteurianum)、柔嫩梭菌(C. leptum)。其中弓形桿菌屬的嗜低溫弓形桿菌、布氏弓形桿菌和梭菌屬的產(chǎn)氣莢膜梭菌、丁酸梭菌為優(yōu)勢(shì)菌種。

2.2 弓形桿菌屬和梭菌屬排污口分布特點(diǎn)

弓形桿菌屬分別是3月份S1、S2和S8站點(diǎn); 5月份S2、S3和S5站點(diǎn); 8月份S2、S3站點(diǎn)和10月份S1、S2與S3站點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌屬。由圖2可以看出, 弓形桿菌屬主要分布在工業(yè)排污口和市政排污口, 而在排污河類(lèi)型的排污口檢出次數(shù)很少。這也與許小紅等(2009)在對(duì)菜市場(chǎng)污水細(xì)菌多樣性分析的結(jié)果一致,該研究認(rèn)為弓形桿菌屬在菜市場(chǎng)污水中所在的比例最高, 高達(dá) 27.6%, 而市政排污口的污水來(lái)源于生活污水。工業(yè)排污口和市政排污口的污染物中氮氨、磷酸鹽的含量比較高, 而排污河類(lèi)型的排污口處氮、磷含量相對(duì)較低, 因此推測(cè)工業(yè)排污口和市政排污口處的較高的氮、磷含量造成了弓形桿菌屬的大量繁殖。

圖2 弓形桿菌屬在排污口的分布情況Fig.2 Distribution of Arcobacter in outlet

對(duì)比弓形桿菌屬, 梭菌屬卻只在3月份的S7站點(diǎn)呈現(xiàn)出相對(duì)較高的比例(7.5%), 在其它月份、站點(diǎn)均不是優(yōu)勢(shì)菌屬, 所占比例均在2%以下(圖3)。王想霞等(2000)在對(duì)濮陽(yáng)市肉毒梭菌生態(tài)分布的研究中也得出相應(yīng)的結(jié)論, 其研究結(jié)果顯示, 肉毒梭菌在土壤中的分布最高, 達(dá)到 14.6%, 而污水的分離比率卻只有 4.7%, 說(shuō)明肉毒梭菌的主要分布區(qū)域是土壤, 而非污水(王想霞等, 2000)。同樣, 石家莊市肉毒梭菌在環(huán)境中的分布也呈現(xiàn)相同的趨勢(shì), 土壤中肉毒梭菌的分離比率為 5.3%, 要高于水樣 2.0%(郭占景等,2010)。

從弓形桿菌屬的分布看, S1站點(diǎn)與S2站點(diǎn)、S4站點(diǎn)與S5站點(diǎn)和S6站點(diǎn)與S8站點(diǎn)的分布情況最為接近, 而從梭菌屬的分布看, S2站點(diǎn)與S3站點(diǎn)、S4站點(diǎn)與S5站點(diǎn)、S6與S8站點(diǎn)和S10站點(diǎn)和S7站點(diǎn)的分布情況最為接近(圖 4), 結(jié)合弓形桿菌和梭菌屬的站點(diǎn)聚類(lèi)結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)無(wú)論是弓形桿菌屬還是梭菌屬, S4站點(diǎn)與S5站點(diǎn), S6站點(diǎn)與S8站點(diǎn)的分布均呈現(xiàn)出高度相似的特點(diǎn)。從排污口的類(lèi)型上看, S4站點(diǎn)與S5站點(diǎn)是工業(yè)性排污口, S6站點(diǎn)與S8站點(diǎn)都是排污河, 因此可以推測(cè)弓形桿菌屬和梭菌屬的分布與排污口的類(lèi)型存在較密切的聯(lián)系。

2.3 弓形桿菌屬和梭菌屬排污口分布相關(guān)性分析

數(shù)據(jù)的SPSS分析發(fā)現(xiàn)(表1), 梭菌屬和弓形桿菌屬的偏度和峰態(tài)均大于 1, 不符合正態(tài)分布, 故對(duì)兩者進(jìn)行相關(guān)性分析時(shí), 采用 Spearman相關(guān)性分析方法, 分析結(jié)果顯示梭菌屬和弓形桿菌屬的相關(guān)性系數(shù)為0.536, 顯著性(雙邊檢驗(yàn))為小于0.05, 說(shuō)明兩者數(shù)據(jù)之間呈現(xiàn)正相關(guān)性, 且相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 梭菌屬在排污口的分布情況Fig.3 Distribution of Clostridium in outlet

圖4 站點(diǎn)聚類(lèi)分析圖Fig.4 The cluster analysis of sites

表1 弓形桿菌屬和梭菌屬描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.1 Descriptive statistics result of Arcobacter and Clostridium

2.4 弓形桿菌屬和梭菌屬在排污口處的分布與時(shí)間關(guān)系

3月份, 弓形桿菌屬在 S1象山爵溪東塘排污口檢出次數(shù)最高(444次)。梭菌屬在S7寧海西店崔家綜合排污口檢出次數(shù)最高(211次); 5月份, 弓形桿菌屬在S5象山墻頭綜合排污口檢出次數(shù)最高(4122次)。梭菌屬在S2象山水桶岱垃圾場(chǎng)排污口檢出次數(shù)最高(189次); 8月份, 弓形桿菌屬在S3象山石浦水產(chǎn)加工園區(qū)排污口檢出次數(shù)最高(467次), 其它排污口檢出次數(shù)均相對(duì)較低。梭菌屬S3象山石浦水產(chǎn)加工園區(qū)排污口檢出次數(shù)最高(25次); 10月份, 弓形桿菌屬在S3象山石浦水產(chǎn)加工園區(qū)排污口檢出次數(shù)最高(541次)。梭菌屬在S7寧海西店崔家綜合排污口檢出次數(shù)最高(13次)(圖 5, 圖 6)。

弓形桿菌屬最適生長(zhǎng)溫度為 25—30°C, 在 37°C和 42°C 下生長(zhǎng)不良, 4°C 下幾乎不生長(zhǎng)(畢水蓮等,2013), 2011年寧波5月份日均最低溫度為17°C, 最高溫度為 25°C, 另外 S5排污口屬于工業(yè)型排污口, 污染物中含有大量的無(wú)機(jī)氮和活性磷酸鹽, 從而造成弓形桿菌屬的大量生長(zhǎng), 其在5月份, S5排污口的檢出量明顯高于其它月份。寧波8月份日均最低溫度為25°C, 日均最高溫度為 32°C, 但是由于高溫使部分企業(yè)停工, 污水排放量減少, 沒(méi)有造成弓形桿菌屬大量繁殖(謝利等, 2016)。梭菌屬適宜生長(zhǎng)溫度范圍較廣, 為10—65°C, 其在3月份, S7號(hào)排污口檢出量最多, S7號(hào)排污口為工業(yè)型排污口, 污染物中含有大量的氮、磷, 有利于梭菌屬的生長(zhǎng)。但是梭菌屬不適宜在水中生長(zhǎng), 主要廣泛存在于土壤, 淤泥及人和動(dòng)物腸道中(Stewart et al, 1990; 鄧志愛(ài)等, 2006), 所以各個(gè)月份與弓形桿菌屬相比檢出量均較低。

圖5 弓形桿菌屬各月份的分布情況Fig.5 Distribution of Arcobacter in each month

弓形桿菌屬是一類(lèi)人畜共患的食源性和水源性病原菌(Ho et al, 2006), 可導(dǎo)致人類(lèi)胃腸炎和菌血癥, 引起的胃腸炎的臨床病癥與彎曲桿菌病類(lèi)似(畢水蓮等, 2009)。低溫弓形桿菌和布氏弓形桿菌主要寄生在動(dòng)物性食物中, 尤其是雞肉(Rivas et al,2004), 其中布氏弓形桿菌被認(rèn)為造成腹瀉疾病的第四大病原菌(Ferreira et al, 2014), 梭菌屬主要通過(guò)外毒素的方式, 引起人畜共患病, 例如產(chǎn)氣莢膜可共產(chǎn)生 12種毒素, 主要造成人畜腸胃患病(陳小云, 2005), 而肉毒梭菌易于通過(guò)污染食物而引起人畜患病。因此, 采取以預(yù)防為主的手段是非常必要的, 可以從消滅或者減少食物鏈中的弓形桿菌屬和梭菌屬入手, 按照不同菌種在不同月份的生長(zhǎng)特點(diǎn)對(duì)排污口進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)控。

3 結(jié)論

利用454高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn), 寧波沿海2個(gè)重點(diǎn)排污口、8個(gè)一般排污口的 20個(gè)站位的弓形桿菌屬有2個(gè)種和梭菌屬有12個(gè)種。弓形桿菌屬比較適合在工業(yè)型和市政型污水生長(zhǎng), 而梭菌屬只有3月份的 S7號(hào)排污口檢出量較高, 其它排污口均較低。弓形桿菌屬和梭菌屬的分布與排污口的類(lèi)型有著較密切的聯(lián)系, 相同類(lèi)型的排污口有著高度相似分布特點(diǎn)。季節(jié)性不同而引起的溫度差異, 也會(huì)引起兩種微生物生長(zhǎng)狀態(tài)的變化, 弓形桿菌屬受溫度影響較大,梭菌屬適宜生長(zhǎng)溫度范圍較大, 而且兩者的分布數(shù)據(jù)呈現(xiàn)正相關(guān)性。弓形桿菌屬和梭菌屬都容易通過(guò)水源和食物鏈危害人類(lèi)健康, 弓形桿菌屬容易造成人體腸胃炎和腹瀉等疾病, 梭菌屬可以造成多種由其外毒素引起的疾病, 如破傷風(fēng), 惡性水腫和腸毒血癥等疾病, 所以應(yīng)該依照不同季節(jié)和不同類(lèi)型的排污口針對(duì)性地對(duì)兩種微生物進(jìn)行監(jiān)控和治理, 防止污染水體和其它水生生物。

圖6 梭菌屬各月份的分布情況Fig.6 Distribution of Clostridium in each month

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