綿羊ANGPTL4蛋白在脂肪組織中的表達研究

張靜，張方，胡子喬，潘洋洋，喬利英，劉文忠*

(山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801)

摘要：血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)是一種與脂肪代謝相關(guān)的分泌性蛋白。本研究利用Western blotting 技術(shù)檢測了兩個不同品種的脂尾型綿羊，即廣靈大尾羊和小尾寒羊的2、4、6、8、10和12月齡時的母羊(每年齡段2只)，共24個個體的皮下、腹膜后、腎周和尾部脂肪組織的ANGPTL4蛋白的表達量。結(jié)果表明：品種、月齡和組織對ANGPTL4蛋白的表達都有極顯著(P<0.001)影響。品種與月齡的互作對該蛋白表達也有顯著(P<0.01)影響。本研究結(jié)果為進一步探討ANGPTL4蛋白在綿羊脂肪組織中的作用機制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：綿羊；ANGPTL4蛋白；脂肪組織；Western blotting；表達

收稿日期：2015-09-24修回日期：2015-10-18

作者簡介：張靜(1992-)，女(漢)，山西懷仁人，碩士研究生，研究方向：脂肪代謝相關(guān)基因

通訊作者：*劉文忠，教授，博士生導師。Tel：0354-6288337；E-mail：tglwzyc@163.com

基金項目：國家自然科學基金 (30972084)；山西農(nóng)業(yè)大學青年學術(shù)帶頭人項目(XD201205)；山西省科技攻關(guān)項目(011029)

中圖分類號：S826文獻標識碼：A

Expression of ANGPTL4 in Ovine Adipose Tissues

Zhang Jing1, Zhang Fang, Hu Ziqiao, Pan Yangyang, Qiao Liying, Liu Wenzhong*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Abstract:Angiopoietin-like protein 4 (ANGPTL4) is a kind of secretory protein related to fat metabolism. (Objective) To detect the expression of ANGPTL4 protein in different adipose tissues of two breeds with distinct fat tail, adipose tissue samples from subcutaneous, retroperitoneal, perirenal and tail fats were collected from twenty-four females in six age groups and from two breeds, i.e. Guangling Large Tailed (GLT) and Small Tailed Han sheep (STH) were detected by Western blotting in this study. The results showed that breed, month of age and adipose tissues influence ANGPTL4 protein expression significantly (P<0.001). Significant interaction (P<0.01) between breed and month of age was also obtained. These results provide theoretical bases for mechanism of ANGPTL4 protein in ovine adipose tissues.

Key words:Sheep; ANGPTL4 protein; Adipose tissues; Western blotting; Expression

ANGPTL4蛋白是一種由ANGPTL4基因編碼，與血管生成相關(guān)的蛋白。作為分泌蛋白，ANGPTL4含有一個信號肽，一個N端卷曲螺旋的四級結(jié)構(gòu)(coiled-coil domain, CCD)和一個C端纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域(fibrinogen-like domain, FLD)[1,2]。CCD介導同源寡聚體的合成，也可以抑制脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)的活性[3]，跨膜域的酶切可增強抑制作用[4]。而FLD可調(diào)節(jié)配體的活性，可能與蛋白質(zhì)間的互作有關(guān)。

ANGPTL4由很多組織分泌，但主要以肝臟和白色脂肪組織為主。該蛋白分子量在45～65 kDa，且以多種形式存在于不同組織。人和小鼠血漿中的ANGPTL4以全長和截短兩種形式存在。小鼠3T3-L1脂肪細胞中，只能檢測到截短的ANGPTL4。人類WAT中只有全長形式存在，而肝臟只分泌截短型蛋白[1]。血漿中的ANGPTL4主要以截短型存在[5]。一些前蛋白轉(zhuǎn)化酶，如枯草桿菌蛋白酶(proprotein convertase subtilisin/ kexin type3, PCSK3)，弗林蛋白酶(furin)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換酶(proprotein convertase 5/6, PC5/6)等可通過識別特定的氨基酸序列R161RKR164水解ANGPTL4蛋白[4,6]。

小鼠ANGPTL4蛋白主要在白色和棕色脂肪組織中表達，在卵巢、心臟、肝臟、骨骼肌、腸[7,8]、下丘腦、皮質(zhì)和垂體[9]中都有表達。人ANGPTL4蛋白廣泛表達，在肝臟、脂肪、血漿、胎盤、小腸和心臟中高表達[8,10]，但存在明顯的個體差異[5,11]。

本研究利用Western blotting技術(shù)對綿羊ANGPTL4蛋白在兩個不同脂尾型綿羊中的差異表達進行研究，旨在為進一步探討ANGPTL4在綿羊脂肪代謝中的作用機制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

ANGPTL4單克隆兔抗購自Abcam公司(英國)，(-actin兔抗，山羊抗兔IgG，哺乳動物組織蛋白提取試劑，PMSF，BCA蛋白定量試劑盒，凝膠蛋白質(zhì)快速藍染試劑盒，硝酸纖維素NC膜，Tween 20，印跡膜麗春紅染液，彩色預(yù)染中分子蛋白質(zhì)分子量標準和超敏ECL化學發(fā)光即用型底物均購自武漢博士德生物工程有限公司。Tris、SDS、N,N′-甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、丙烯酰胺、溴酚藍、甘氨酸、無水乙醇、NaCl和脫脂奶粉均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2試驗動物與樣品采集

本研究以廣靈大尾羊和小尾寒羊為研究對象。分別屠宰兩個品種2、4、6、8、10和12月齡時的母羊，每年齡段2只。采集共24個個體的皮下、腹膜后、腎周和尾部脂肪組織，立即用滅菌錫箔紙包好，迅速放入液氮中備用。

1.3蛋白質(zhì)提取和Western blotting試驗步驟

參考哺乳動物組織蛋白提取試劑和PMSF試劑說明書提取組織蛋白，并用BCA蛋白定量試劑盒對所提蛋白進行定量濃度檢測。按照每個樣品總蛋白上樣量為30 μg來計算各組織蛋白樣品所需上樣體積，在蛋白樣品中加入適量的5×SDS-PAGE上樣緩沖液，使其工作濃度為1×，最后用去離子水補齊至10 μL。將制備好的蛋白樣品放入金屬浴中約10 min，使蛋白完全變性，解聚。制備好SDS-PAGE凝膠后，將變性后的蛋白樣品加入點樣孔后進行電泳。電泳條件為80 V，40 min，120 V，90 min。電泳后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素NC膜上。用TBST清洗3次后，再用蒸餾水清洗3次，放入2%的脫脂奶粉中封閉約1.5 h。將含有目的條帶的膜孵育ANGPTL4單克隆兔抗，內(nèi)參條帶的膜孵育為β-actin兔抗，4 ℃過夜。次日取出后，用TBST清洗3次，再用蒸餾水清洗3次，將兩張膜均放入山羊抗兔IgG中孵育約2 h，用TBST清洗3次后，再用蒸餾水清洗3次。使用超敏ECL化學發(fā)光即用型底物對兩張膜進行曝光拍照處理，并記錄結(jié)果。

1.4Western blotting試驗結(jié)果分析

應(yīng)用Image Lab軟件對成像之后保存的圖片進行結(jié)果分析。測定目的條帶面積和灰度值。將目的蛋白與內(nèi)參蛋白進行對比，應(yīng)用下列公式進行半定量分析。

蛋白含量=條帶面積×平均灰度值

目的蛋白半定量值=目的蛋白含量/β-actin蛋白含量

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 17.0軟件(SPSS Science, Chicago, IL, USA)中一般線性模型(general linear model, GLM)過程對綿羊ANGPTL4蛋白相對表達量進行單變量方差分析。試驗考慮的主效應(yīng)有品種、月齡和組織，二階互作效應(yīng)為3個主效應(yīng)兩兩間的互作。配合模型如下：

yiklm= μ+Bi+Tk+Ml+BTik+BMil+

TMkl+eiklm

式中，yiklm為綿羊ANGPTL4蛋白相對表達量，μ為總體均值；Bi為第i個品種效應(yīng)(i=1,2)；Tk為第k種脂肪組織效應(yīng)(k=1, 2, …, 4)；Ml為第l個月齡效應(yīng)(l=2, 4, …, 12)；BTik、BMil和TMkl表示兩因素互作效應(yīng)；eiklm為殘差。用Duncan(s法對各因素不同水平間的差異進行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1脂肪組織中總蛋白

蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量會直接影響后續(xù)試驗的成功與否。圖1為本試驗提取的蛋白質(zhì)樣品的SDS-PAGE垂直電泳圖。本試驗的目的蛋白分子量為50 kDa，內(nèi)參蛋白分子量為43 kDa。由圖可知，蛋白樣品經(jīng)電泳分離后，條帶明顯、整齊清晰且完整無缺失。表明蛋白質(zhì)樣品和SDS-PAGE電泳中的分離膠和濃縮膠濃度均符合試驗要求。條帶無明顯的粗細不均勻，表明蛋白質(zhì)上樣量統(tǒng)一合理。圖2為曝光后的部分條帶圖。圖3為兩品種6個年齡段的ANGPTL4蛋白相對表達量。

2.2ANGPTL4蛋白相對表達量與影響因素

2.2.1影響ANGPTL4蛋白表達量的因素

方差分析(表1)可知，品種、月齡和組織均極

圖1　SDS-PAGE電泳分離條帶后反應(yīng)的總蛋白提取效果 Fig.1　The gel electrophoresis bands of extracted total protein by SDS-PAGE

圖2　部分Western blotting條帶圖 Fig.2　Western blotting bands of ANGPTL4 from different tissues

圖3　兩品種6個年齡段的ANGPTL4相對表達量 Fig.3　ANGPTL4 relative expressive abundances in six ages of two breeds

顯著(P<0.001)地影響ANGPTL4蛋白的表達。品種與月齡的互作也顯著(P<0.01)影響該蛋白的表達量。

2.2.2ANGPTL4蛋白的表達豐度

表2給出了綿羊ANGPTL4蛋白在不同品種、組織和月齡中的表達量。從品種上來看，

表1　 ANGPTL4蛋白表達豐度的方差分析

NS: Not significant, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

ANGPTL4蛋白在小尾寒羊中的表達量(0.308)顯著(P<0.001)低于廣靈大尾羊(0.716)。從組織來看，ANGPTL4在4種脂肪組織中的表達量差異顯著(P<0.001)。皮下脂肪中的表達量(0.755)最高，且顯著高于(P<0.001)其他組織。其次是尾脂(0.573)，腎周脂肪組織表達量最低(0.285)。從月齡來看，10月齡時的ANGPTL4蛋白表達量最高，且顯著(P<0.001)高于其他月齡。12月齡次之。8月齡(0.579)、4月齡(0.448)、6月齡(0.446)逐漸降低，2月齡時表達量最低(0.166)。

表2　綿羊ANGPTL4蛋白表達豐度

*不同字母表示同一因素不同水平間差異顯著(P<0.05)。

* Values with different superscripts within the same factor differ significantly (P<0.05).

二因素互作中，品種與月齡的互作對ANGPTL4蛋白表達有顯著影響(P<0.01)。由圖4可知，ANGPTL4蛋白受品種與月齡互作的影響主要來源于小尾寒羊中6月齡的表達量低于4月齡，12月齡的表達量稍高于10月齡。但廣靈大尾羊6月齡表達量高于4月齡，而在12月齡的表達量顯著低于10月齡，與小尾寒羊的情況正好相反。

圖4　二因素互作對綿羊ANGPTL4蛋白表達的影響 品種：1 小尾寒羊；2 廣靈大尾羊 Fig.4　Effects of two-way interactions on the expression of ovine ANGPTL4 protein Breed: 1 Small Tailed Han (STH); 2 Guangling Large Tailed sheep (GLT)

3討論

3.1ANGPTL4蛋白的表達

ANGPTL4蛋白在不同的物種中表達略有差異。大量研究表明ANGPTL4蛋白最初在脂肪細胞中分泌表達，在肝臟、心臟和骨骼肌中高表達[12～15]。小鼠的ANGPTL4蛋白主要在脂肪組織中表達(包括白色和棕色脂肪組織)，在肝臟和下丘腦中也有表達[16]。而人的ANGPTL4蛋白則廣泛表達[5,8]。就脂肪組織來看，不同脂肪組織中的ANGPTL4蛋白表達豐度也不盡相同。Dutton等[17]對小鼠研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4蛋白在5種脂肪組織中都有表達，其中皮下脂肪中的表達量低于附睪和腎周脂肪組織中的表達量。經(jīng)免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，人的ANGPTL4蛋白在網(wǎng)膜中表達，但皮下和乳腺脂肪組織中不表達[18]。本研究中，綿羊ANGPTL4蛋白在4種脂肪組織中均有表達，且皮下脂肪中表達量最高。這與人和小鼠中的研究略有不同?？赡苁怯捎谠摰鞍椎谋磉_在物種間存在差異性。皮下是儲存脂肪的重要部位，由此可說明ANGPTL4蛋白有利于綿羊皮下脂肪的沉積。對綿羊的定向培育也可能是導致綿羊皮下脂肪沉積量顯著高于其它組織的原因。

3.2影響ANGPTL4蛋白表達的因素

品種對綿羊ANGPTL4蛋白的表達有顯著影響。本試驗中，廣靈大尾羊ANGPTL4蛋白的表達量顯著高于小尾寒羊。ANGPTL4通過抑制脂蛋白脂肪酶的活性引起甘油三酯的沉積。可見，廣靈大尾羊較小尾寒羊有更強的脂肪沉積能力[19,20]。Feng等[21]對肥胖型和瘦肉型豬的研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4在肥胖型豬中的表達量高于瘦肉型豬中的表達量。說明ANGPTL4蛋白在不同物種中，都具有促進脂肪沉積的作用。

季節(jié)對ANGPTL4蛋白表達也有顯著的影響。本研究中，2月齡到6月齡實際對應(yīng)于1月到5月，該時間段為枯草季。8月齡到12月齡實際對應(yīng)于7月到11月，為青草季節(jié)。在10月齡時對應(yīng)于9月份，牧草豐富，進食量大。此時ANGPTL4蛋白的表達豐度最高，抑制脂蛋白脂肪酶的活性，導致脂肪的沉積。在2月齡時(即1月份)羊群進食量明顯減少，ANGPTL4蛋白表達量最低，脂肪沉積量也降低。

4小結(jié)

本文利用PCR-SSCP的方法對廣靈大尾羊和小尾寒羊兩品種的ANGPTL4蛋白相對表達量進行研究。發(fā)現(xiàn)品種、月齡和組織對ANGPTL4蛋白的表達都有極顯著(P<0.001)影響。品種與月齡的互作對該蛋白表達也有顯著(P<0.01)影響。

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(編輯：武英耀)