·論著·

蛋白標(biāo)志物在荷人卵巢癌裸鼠移植瘤與化療后移植瘤中的表達(dá)差異

孫亞楠侯連國賈曉鵬崔娜張彩虹

項(xiàng)目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號：20130005)

作者單位： 050082石家莊市，中國人民解放軍白求恩和平醫(yī)院婦產(chǎn)科(孫亞楠、張彩虹)；河北醫(yī)科大學(xué)生化教研室(侯連國)；河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院(賈曉鵬);河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院(崔娜)

【摘要】目的建立荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，給予順鉑(DDP)最大可耐受劑量化療(maximumtolerateddose chemotherapy，MTD-DDP)和順鉑低劑量節(jié)拍化療(low-dose metronomic chemotherapy，LDM-DDP)，探討初發(fā)移植瘤與不同模式化療后移植瘤中乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistant protein，BCRP)、P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1(aldehyde dehydrogenase 1, ALDH1)表達(dá)水平的差異。方法用人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株建立荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，60只裸鼠隨機(jī)分為MTD-DDP組、LDM-DDP組和對照組，每組20只。2周成瘤后處死對照組裸鼠，用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting, WB)檢測移植瘤組織中BCRP、P-gp和ALDH1的表達(dá)水平。MTD-DDP組、LDM-DDP組在化療結(jié)束后處理裸鼠，用相同方法檢測化療后移植瘤組織中移植瘤組織中BCRP、P-gp和ALDH1的表達(dá)水平，探討造成差異的原因。結(jié)果60只裸鼠均成瘤，成瘤率為100%。LDM-DDP和 MTD-DDP組的BCRP蛋白表達(dá)水平低于對照組，且LDM-DDP組BCRP表達(dá)水平低于MTD-DDP組(P<0.05)。 MTD-DDP組、LDM-DDP組P-gp蛋白表達(dá)均高于對照組，且LDM-DDP組P-gp表達(dá)水平低于MTD-DDP組(P<0.05)。LDM-DDP和MTD-DDP組的ALDH1表達(dá)低于對照組，且LDM-DDP組ALDH1表達(dá)水平低于MTD-DDP組(P<0.05)。結(jié)論與LDM-DDP組相比較，MTD-DDP組化療后殘余瘤中耐藥相關(guān)蛋白高表達(dá)，且更易富集腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH1，LDM是一種未來可供選擇的，目的在于提高化療敏感性、降低復(fù)發(fā)耐藥的化療模式。

【關(guān)鍵詞】卵巢上皮性癌；DDP化療；多藥耐藥相關(guān)蛋白；蛋白印跡法

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.22.036

【中圖分類號】R 737.31【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

收稿日期：(2015-06-15)

卵巢癌是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]，卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)往往占卵巢癌總發(fā)病率的90%，該病通常在晚期發(fā)現(xiàn)，迄今為止，沒有高度有效的針對治療策略。傳統(tǒng)的治療通常包括腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和后續(xù)以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，但近1/2患者在18月內(nèi)復(fù)發(fā)[2]，同時(shí)因?yàn)镋OC容易產(chǎn)生化療耐藥，EOC極易復(fù)發(fā)，使得5年生存率長期徘徊在20%～40%[3]。傳統(tǒng)的最大耐受劑量化療(MTD)往往是通過殺死對化療敏感的絕大部分增殖狀態(tài)的卵巢癌細(xì)胞，可以有效控制腫瘤,但副反應(yīng)較重且易產(chǎn)生化療耐藥。因此，就MTD模式，有學(xué)者提出低劑量節(jié)拍化療(LDM)，LDM模式是一種新的化療模式，化療總劑量需等同于MTD化療模式[4,5]。化療方式通常采用常規(guī)化療劑量1/10～1/3，高頻率/脈沖式持續(xù)(一般為每天或每3天或每7天)給藥方式，不僅能有效的縮短化療間歇期，增加腫瘤細(xì)胞在化療藥物中暴露的時(shí)間，還能以新生血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞作為靶目標(biāo)，減輕化療副反應(yīng)，且很少產(chǎn)生骨髓抑制，從而成為一個(gè)有吸引力的和行之有效的抗腫瘤復(fù)發(fā)的策略[6-8]。本實(shí)驗(yàn)通過建立荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，分別給予MTD化療和LDM化療，觀察未給予化療及給予上述兩種化療后移植瘤中相關(guān)耐藥蛋白和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1表達(dá)差異，探討造成差異可能的機(jī)制，為臨床尋找一種新的化療模式提供思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物本實(shí)驗(yàn)選取雌性BALB/c裸鼠，小鼠6～8周齡，體重18～20 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，合格證為SCXK(京)2013-004，在SPF級條件下飼養(yǎng)，所有動物實(shí)驗(yàn)操作過程均遵照國際動物委員會制定的倫理道德規(guī)范。

1.2細(xì)胞株人卵巢癌漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV3由中科院上海細(xì)胞庫提供，中高分化，貼壁生長，本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，SKOV3細(xì)胞接種于含10%胎牛血清(FBS)的McCoy’s-5A液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫，含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑McCoy’s-5A培養(yǎng)液購自美國Gibico公司；注射用順鉑購自云南生物谷燈盞花藥業(yè)；Anti-BCRP 抗體，Anti-P-gp 抗體，Anti-ALDH1抗體購自美國Millipore 公司。

1.4建立裸鼠皮下移植瘤模型取對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞1×107個(gè)接種于裸鼠右側(cè)大腿皮下，建立荷人卵巢癌異種移植瘤模型。將60只裸鼠隨機(jī)分為3組，對照組，MTD-DDP組，LDM-DDP組，每組20只。成瘤后處死對照組裸鼠，進(jìn)行Western-Blot法檢測移植瘤中BCRP、P-gp和ALDH1的表達(dá)。無菌條件下取出裸鼠皮下移植瘤，提取組織總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取30 μg等量蛋白上樣，10%SDS-PAGE膠用以分離蛋白，20 V恒壓、130 mA條件下轉(zhuǎn)膜30 min。封閉液封閉蛋白轉(zhuǎn)移膜1 h。加入一抗BCR抗體、P-gp抗體及ALDH1(1∶500稀釋)，室溫孵育，12 h。第2天洗滌未結(jié)合一抗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)，室溫孵育1 h。避光顯色，X線膠片曝光。膠片經(jīng)URP Imagestore 7500凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，分析條帶灰度值。待測蛋白表達(dá)量與內(nèi)參照β-actin表達(dá)量進(jìn)行對比，表示蛋白的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5化療總劑量相同，MTD-DDP組：DDP 3 mg/kg，1次/3 d，腹腔注射共6次；LDM-DDP組DDP1 mg/kg，1次/d，腹腔注射共18次。

2結(jié)果

2.1成瘤率60只裸鼠皮下異種移植瘤模型2周均能成瘤，成瘤率100%。

2.2蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果BCRP蛋白表達(dá)：BCRP蛋白表達(dá)水平均在MTD-DDP組和LDM-DDP組均高于對照組(P<0.05)；而LDM-DDP組BCRP蛋白表達(dá)顯著低于MTD-DDP組(P<0.05)。P-gp蛋白表達(dá)：P-gp蛋白表達(dá)水平在MTD-DDP組和LDM-DDP組均高于對照組(P<0.05)；而LDM-DDP與MTD-DDP組之間P-gp蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。ALDH1表達(dá)：ALDH1蛋白表達(dá)水平在MTD-DDP組和LDM-DDP組均高于對照組(P<0.05)；而LDM-DDP組中ALDH1蛋白表達(dá)水平低于MTD-DDP組(P<0.05)。見表1、圖1。

表1　荷人卵巢癌裸鼠模型中，在對照組，MTD組和LDM組中

注：與對照組比較，*P<0.05；與MTD組比較，#P<0.05

圖1荷人卵巢癌裸鼠模型中，在對照組，MTD組和LDM組中BCRP、P-gp和ALDH1蛋白表達(dá)水平檢測

3討論

MTD化療模式能有效抑制腫瘤生長，但伴有較重的化療副反應(yīng)，而臨床上在兩次化療之間常存在間歇期，而在間歇期內(nèi)，部分腫瘤細(xì)胞處于細(xì)胞分裂周期的靜止期[9,10]，可以躲避化療及放療的攻擊，高表達(dá)耐藥蛋白，相比較成熟細(xì)胞，其化療敏感性低，從而迅速增殖[11]。

LDM化療模式通常采用常規(guī)化療劑量1/10～1/3，高頻率/脈沖式持續(xù)(一般為每天或每3天或每7天)給藥方式，不僅能有效的縮短化療間歇期，增加腫瘤細(xì)胞在化療藥物中暴露的時(shí)間，還能以新生血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞作為靶目標(biāo)，阻斷內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，CEP)的活化，減輕化療副反應(yīng)，因?yàn)獒槍?nèi)皮細(xì)胞，LDM化療模式幾乎不產(chǎn)生骨髓抑制，從而成為一個(gè)有吸引力的和行之有效的抗腫瘤復(fù)發(fā)的策略。

研究人員認(rèn)為，腫瘤具有異構(gòu)性，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的細(xì)胞，在腫瘤中只占據(jù)一小部分，負(fù)責(zé)腫瘤的起始、維持和發(fā)生，稱之為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)。ALDH1是維甲酸信號通路(干細(xì)胞分化的關(guān)鍵途徑)的中心表達(dá)酶類，通常在干細(xì)胞中高度表達(dá)。ALDH1已經(jīng)從大量患者樣本和試驗(yàn)中鑒定和分離出來，也被視作一些列惡性腫瘤的CSC標(biāo)志蛋白，包括乳腺、結(jié)腸、大腦、肝臟、肺和卵巢[12-16]。傳統(tǒng)的MTD模式無法有效的針對這一小部分干性最強(qiáng)的卵巢癌干細(xì)胞做出強(qiáng)有力的殺傷，與此相反的是，MTD化療模式更能富集具有干性特征的卵巢癌干細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，MTD-DDP組ALDH1蛋白表達(dá)高于LDM-DDP組和對照組。說明在卵巢癌內(nèi)部的腫瘤細(xì)胞具有層級制度，MTD-DDP模式能大量殺死對化療敏感的腫瘤細(xì)胞，對化療不敏感的細(xì)胞開始激活，占據(jù)主導(dǎo)地位，隨著化療次數(shù)增多，不敏感細(xì)胞逐漸增多，最終導(dǎo)致化療耐藥，腫瘤復(fù)發(fā)。

P-gp和BCRP是最常見的多藥耐藥ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。P-gp通過與抗腫瘤藥物相結(jié)合，依賴ATP水解能量將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外，從而降低胞內(nèi)化療藥物的濃度，使得腫瘤耐藥。除此之外，如果正常細(xì)胞持續(xù)表達(dá)P-gp往往被認(rèn)為是癌變標(biāo)志。文獻(xiàn)報(bào)道，P-gp在腫瘤組織中含量高的患者對化療敏感性差，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[17]。本研究顯示，MTD-DDP組、LDM-DDP組P-gp蛋白表達(dá)均高于對照組(P<0.05)，但前二者之間無明顯差異，我們因此推測，P-gp能夠在EOC化療耐藥起到一定的作用，但并非主導(dǎo)作用。BCRP也是多耐藥蛋白，它作用的機(jī)制是通過將藥物從細(xì)胞中“排出”，進(jìn)而影響化療藥物的吸收，改變化療藥物的作用和濃度。徐志宏等研究學(xué)者提出BCRP的過度表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)明顯相關(guān)[18]，在耐藥方面起很大作用。一旦腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)BCRP，則可呈現(xiàn)對多種化療藥物的抵抗性[19]。本研究顯示，MTD-DDP組、LDM-DDP組P-gp蛋白表達(dá)均高于對照組(P<0.05)，且LDM-DDP組BCRP蛋白表達(dá)顯著低于MTD-DDP組(P<0.05)，說明LDM模式確實(shí)可以降低化療藥物的耐藥性，減少復(fù)發(fā)。

綜上所述，本研究中，耐藥相關(guān)蛋白BCRP、P-gp和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1在經(jīng)過化療的裸鼠移植瘤內(nèi)含量明顯高于未經(jīng)化療的裸鼠，以MTD組最高，說明MTD組能夠在某種程度上富集卵巢癌干細(xì)胞，使得對化療敏感度低的細(xì)胞富集，而LDM模式能夠降低卵巢癌干細(xì)胞比例，持續(xù)無間歇給藥能夠阻止CSCs重新形成腫瘤，增強(qiáng)化療敏感性，因此如果能將LDM化療模式成功的應(yīng)用于卵巢癌臨床化療中，將極大的增強(qiáng)抑瘤效果，減低復(fù)發(fā)。

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