脊髓繼發(fā)性損傷大鼠脊髓組織中丙烯醛表達、SOD活性及MDA含量變化

張月娥1，許燦1，藺靜1，黃一茜1，張靜2

(1保定市第一中心醫(yī)院，河北保定071000；2河北醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院)

摘要：目的觀察脊髓繼發(fā)性損傷大鼠脊髓組織中丙烯醛(ACR)表達、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量變化。方法健康雄性SD大鼠48只，隨機分為實驗組30只、假手術(shù)組18只。實驗組采用改良Allen′s-WD法制備大鼠脊髓繼發(fā)性損傷模型，假手術(shù)組暴露脊髓后立即縫合。分別于建模后24 h、3 d、7 d處死大鼠，取脊髓組織，HE染色觀察脊髓組織病理變化，采用免疫組化法檢測脊髓組織中的ACR，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測MDA。結(jié)果實驗組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織中ACR表達量、MDA含量高于相應(yīng)時點假手術(shù)組(P均<0.05)。實驗組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織SOD活性低于假手術(shù)組(P均<0.01)。結(jié)論 大鼠脊髓繼發(fā)性損傷組織中ACR表達及MDA含量升高，SOD活性降低。

關(guān)鍵詞：脊髓損傷；脊髓繼發(fā)性損傷；丙烯醛；超氧化物歧化酶；丙二醛

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.010

中圖分類號：R651.2文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-06-27)

通信作者：張靜

氧化應(yīng)激反應(yīng)在脊髓繼發(fā)性損傷的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用[1]。研究[2]表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生大量自由基如丙二醛(MDA)，耗竭內(nèi)源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)，破壞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，導致脊髓組織損傷進一步加重。臨床清除自由基療法尚未取得滿意效果,有學者推測脊髓繼發(fā)性損傷后可能有毒性更強、半衰期更長的氧化應(yīng)激產(chǎn)物如丙烯醛(ACR)等產(chǎn)生，使損傷持續(xù)進展。2010年5月~2011年1月，我們觀察了大鼠脊髓繼發(fā)性損傷組織中ACR表達、SOD活性及MDA含量變化，并探討其意義。

1材料與方法

1.1實驗動物與材料SPF級健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量240~280 g。兔抗丙烯醛多克隆抗體，PV9003、DAB顯色試劑盒，EZ ECL試劑盒，SOD試劑盒及MDA試劑盒，分光光度計，石蠟切片機，低溫冰箱，半干電轉(zhuǎn)移槽及垂直電泳槽等。

1.2大鼠脊髓繼發(fā)性損傷模型建立將48只SD大鼠隨機分為實驗組30只、假手術(shù)組18只。實驗組根據(jù)改良Allen′s-WD法制作脊髓繼發(fā)性損傷模型：0.3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，暴露T11段脊髓，將打擊裝置整合于立體定位儀上，將一直徑3 mm圓形薄金屬墊片(3 mm×4 mm，質(zhì)量0.1 g)置于T11段脊髓表面，以10 g砝碼從6.5 cm高度自由墜落打擊墊片，造成以T11段為中心的脊髓急性損傷。假手術(shù)組暴露脊髓后立即縫合。分別于建模后24 h、3 d、7 d處死大鼠，取原手術(shù)切口暴露T10~12段，在冰袋上解剖椎管，取出包括損傷段及損傷階段上下段脊髓組織(繼發(fā)性損傷組織)2 cm置于-80 ℃冰箱中保存，留作SOD、MDA檢測。取大鼠脊髓組織，浸入4%中性甲醛溶液12~24 h后，留取損傷區(qū)及其上下各0.5 cm范圍的脊髓組織，以備組織病理學檢查及ACR檢測。

1.3脊髓組織病理觀察將脊髓組織常規(guī)切片脫蠟至水，HE染色后于普通顯微鏡下觀察組織形態(tài)學變化情況。

1.4脊髓組織中ACR、SOD、MDA檢測分別于建模后24 h、3 d、7 d采用免疫組化法檢測脊髓組織中的ACR，以陽性細胞染色的平均光密度值代表表達量。采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性。采用硫代巴比妥酸法檢測MDA。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1脊髓組織病理變化假手術(shù)組神經(jīng)元細胞形態(tài)、數(shù)量正常。實驗組建模后24 h可見局灶性出血，神經(jīng)元腫脹、變圓、數(shù)目減少，神經(jīng)元核固縮、碎裂，尼氏小體淡染或消失；建模后7 d神經(jīng)元數(shù)目減少，內(nèi)有空泡形成。

2.2兩組脊髓組織中ACR表達、SOD活性、MDA含量比較實驗組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織中ACR表達、MDA含量高于相應(yīng)時點假手術(shù)組(P均<0.05)。實驗組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織SOD活性低于相應(yīng)時點假手術(shù)組(P均<0.01)。見表1。

表1　 建模后不同時點兩組脊髓組織中ACR表達、

SOD活性、MDA含量比較( ± s)

表1　 建模后不同時點兩組脊髓組織中ACR表達、

組別nACRSOD活性(U/mgprot)MDA含量(nmol/mgprot)實驗組30 建模后24h0.3636±0.0100124.7±8.812.30±1.20 建模后3d0.3462±0.0157137.7±4.811.90±1.14 建模后7d0.3052±0.0162145.9±5.711.01±1.09假手術(shù)組18 建模后24h0.1613±0.3910*241.3±12.3#6.34±0.50# 建模后3d0.1762±0.2143*262.6±15.6#6.35±0.64# 建模后7d0.2036±0.2452*255.7±16.4#7.01±0.45#

注：與同時點實驗組相比，*P<0.05；與同時點實驗組相比，#P<0.01。

3討論

脊髓繼發(fā)性損傷發(fā)生在原發(fā)性損傷后數(shù)小時、數(shù)天及數(shù)周，可導致原發(fā)傷周圍正常脊髓組織損傷[1]，繼發(fā)性損傷機制包括缺血再灌注損傷、炎癥、氧化應(yīng)激及谷氨酸等興奮性氨基酸毒性等[3]。自由基介導的氧化應(yīng)激反應(yīng)被認為是引起脊髓繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵因素之一[4]。然而目前現(xiàn)有的清除自由基療法臨床療效并不滿意。

研究[5]表明，丙烯醛的損傷作用機制包括兩個方面：其一是作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的誘發(fā)者，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)進入惡性循環(huán)，造成細胞永久損傷；其二是通過與蛋白耦聯(lián)引起細胞凋亡。有學者[6]建立了體外PC12細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)ACR可誘導細胞凋亡，且ACR的細胞毒性較MDA、HNE及其他脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物更強。Due等[7]發(fā)現(xiàn)，在大鼠脊髓損傷模型中，ACR表達顯著增加，推測其在大鼠運動癱瘓及神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生中可能起重要作用。在豚鼠離體壓縮性脊髓損傷模型中，ACR表達在脊髓損傷后4 h開始增高，24 h后達到峰值并能持續(xù)1周甚至更長時間，使ACR對脊髓的損傷作用持續(xù)存在，而使用其特效清除劑后，神經(jīng)元細胞膜損傷明顯減輕[8]。

MDA也是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物[9]，可反映細胞受損后氧自由基含量變化及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。SOD是超氧自由基的特異性清除酶，能明顯減輕自由基介導的脂質(zhì)過氧化損傷，其活性高低可反映機體抗氧化能力的強弱[10]。在繼發(fā)性損傷早期，SOD活力值最高，機體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮作用；然而，隨著ACR表達持續(xù)存在，MDA含量逐漸增加，SOD不斷耗竭，SOD活性也逐漸降低。研究[11]表明，ACR在神經(jīng)退行性疾病患者腦組織中水平升高，增強氧化應(yīng)激水平，引起MDA含量升高，SOD活性下降。

本研究發(fā)現(xiàn)，實驗組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織中ACR表達量、MDA含量高于相應(yīng)時點假手術(shù)組，SOD活性低于相應(yīng)時點假手術(shù)組。上述結(jié)果提示，脊髓損傷后機體內(nèi)部即產(chǎn)生ACR、MDA，隨著ACR、MDA持續(xù)生成，SOD活性降低，脊髓損傷持續(xù)存在。結(jié)合病理觀察結(jié)果，實驗組隨建模時間延長，脊髓組織病理變化逐漸加重，進一步表明大鼠脊髓損傷后，體內(nèi)ACR及自由基大量釋放，對神經(jīng)細胞造成嚴重破壞。今后我們將研究ACR表達與自由基生成的相關(guān)性，尋找相關(guān)清除劑以期減輕ACR對脊髓組織的損傷程度。

參考文獻：

[1] Park J, Muratori B, Shi R. Acrolein as a novel therapeutic target for motor and sensory deficits in spinal cord injury[J]. Neural Regene Res, 2014,9(7):677-683.

[2] 韓珩,熊敏,余化龍,等.積雪草酸抗氧化應(yīng)激效應(yīng)對大鼠急性脊髓損傷的保護作用[J].中華實驗外科,2014,31(4):818-820.

[3] Bareyre FM, Schwab ME. Inflammation degeneration and regeneration in the injured spinal cord:insights from DNA microarrays[J]. Trends Neurosci, 2003,26(10):555-563.

[4] 吳碧華,吳文斌,胡常林.自由基與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[J].川北醫(yī)學院學報,2001,16(4):145-147.

[5] Hamann K, Shi R. Acrolein scavenging:a potential novel mechanism of attenuating oxidative stress following spinal cord injury[J]. J Neurochem, 2009,111(6):1348-1356.

[6] Mizoia M, Yoshidaa M, Saiki R, et al. Distinction between mild cognitive impairment and Alzheimer′s disease by CSF amyloid β40 and β42, and protein-conjugated acrolein[J]. Clin Chim Acta, 2014,430(3):150-155.

[7] Due MR, Park J, Zheng L, et al. Acrolein involvement in sensory and behavioral hypersensitivity following spinal cord injury in the rat[J]. J Neurochem, 2014,128(5):776-786.

[8] Kristin H, Genevieve N, Hui O. Hydralazine inhibits compression and acrolein-mediated injuries in ex vivo spinal cord[J]. J Neurochem, 2008,104(3):708-718.

[9] Hakan T, Toklu HZ, Biber N, et al. Meloxicam exerts neuroprotec-tion on spinal cord trauma in rats[J]. Int J Neurosci, 2011,121(3):142-148.

[10] Liu C, Shi Z, Fan L, et al. Resveratrol improves neuron protection and functional recovery in rat model of spinal cord injury[J]. Brain Res, 2011,1374(2):100-109.

[11] Huang YJ, Jin MH, Pi RB. Acrolein induces Alzheimer′s disease-like pathologies in vitro and in vivo[J]. Toxicol Lett, 2013,217(3):184-191.