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腫瘤抗原MAGE-A9和MAGE-A11在乳腺癌中的表達(dá)及意義

李俊軍，何艷，胡小波，歐陽(yáng)立志

(湖南省腫瘤醫(yī)院暨中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院病理科，湖南長(zhǎng)沙4100013)

【摘要】目的:分析人黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE-A9和MAGE-A11在乳腺正常組織、乳腺良性瘤及乳腺癌組織中的表達(dá)趨勢(shì)，為乳腺癌臨床診斷和生物治療探尋新靶點(diǎn)。方法:選取本院接受并行手術(shù)治療的乳腺良性腫瘤和乳腺癌患者各33例，分別取病灶組織和病灶周邊正常組織制備石蠟病理切片，以免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MAGE-A9和MAGE-A11的表達(dá)水平，并分析其與乳腺癌病理特征的相關(guān)性。結(jié)果: MAGE-A9在正常組織中無(wú)表達(dá)，在乳腺良性瘤和乳腺癌的陽(yáng)性表達(dá)率分別為15.2％和54.5％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); MAGE-A11在正常組織及良性瘤中均無(wú)表達(dá)，僅在乳腺癌中表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)78.8％。MAGE-A9表達(dá)受組織學(xué)分級(jí)、ER、HER-2的影響，組織學(xué)Ⅲ級(jí)患者明顯高于Ⅰ、Ⅱ級(jí)，ER、HER-2陽(yáng)性高于陰性; MAGE-A11表達(dá)僅受到ER、HER-2的影響，ER、HER-2陽(yáng)性高于陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。線性回歸分析結(jié)果顯示MAGE-A9和MAGE-A11表達(dá)水平呈直線正相關(guān)性(y =0.798 1x + 1.278; R2=0.694 8)。結(jié)論: MAGE-A9和MAGEA11可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】MAGE-A9; MAGE-A11;乳腺癌

乳腺癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤之一，當(dāng)前的臨床治療是以手術(shù)為主的綜合治療，根據(jù)患者的病理類型和臨床表現(xiàn)，選擇適當(dāng)?shù)陌ㄊ中g(shù)、放療、化療以及內(nèi)分泌療法等綜合治療措施。然而，外科手術(shù)適用范圍有限，僅針對(duì)早期病變可取得理想效果，對(duì)于已經(jīng)發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或嚴(yán)重分化的患者，其臨床療效欠佳;放、化療缺乏特異性，醫(yī)源性傷害較大［1］。黑色素瘤抗原基因(melanoma associated antigen，MAGE)是癌睪丸抗原(CTA)家族成員，正常生理?xiàng)l件下僅表達(dá)于睪丸組織和胚胎組織。據(jù)報(bào)道，部分腫瘤組織中亦發(fā)現(xiàn)有MAGE表達(dá)，有學(xué)者指出MAGE有望成為腫瘤性疾病的靶抗原之一［2-3］。本研究對(duì)乳腺癌患者的MAGE-A9和MAGE-A11的表達(dá)情況進(jìn)行初步研究，并分析其與乳腺癌病理特征的相關(guān)性。

1　資料和方法

1.1一般資料

選取本院2012年3月至2014年1月收治的33例乳腺癌患者和33例良性瘤患者為研究對(duì)象。乳腺癌:年齡33～68歲，平均(53.6±4.06)歲;病理類型:導(dǎo)管癌21例、小葉癌7例、髓樣癌3例、粘液癌2例;腫瘤體積1.6～6.4 cm3，平均(2.9±0.8)cm3; TNM分期:Ⅰ期9例、Ⅱ期19例、Ⅲ期5例;組織學(xué)分級(jí):Ⅰ級(jí)7例、Ⅱ級(jí)20例、Ⅲ級(jí)6例;良性瘤:乳腺纖維瘤21例、腺瘤12例。

1.2主要儀器和試劑

微波爐(P702: iTP-6，格蘭仕);光學(xué)顯微鏡(XZJ-2030B，江西鳳凰);手動(dòng)切片機(jī)(RM2235，德國(guó)萊卡); MAGE-A9一抗(SAB1411908，Sigma，來(lái)源于小鼠); MAGE-A11一抗(HPA045377，Sigma，來(lái)源于兔); MAGE-A9二抗(Ab150105，Abcam，驢抗小鼠); MAGE-A11二抗(Ab150077，Abcam，山羊抗兔);濃縮型DAB試劑盒(C0168，上海諾淵實(shí)業(yè)有限公司);蘇木精(DH156，上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司);山羊血清(GO-505，上海博升生物技術(shù)有限公司)等。

1.3研究方法

所有患者均于手術(shù)過(guò)程中留取病灶組織和病灶周邊健康組織，制備石蠟病理切片。所得病理切片按一下流程進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)實(shí)驗(yàn): (1)脫蠟至水:60℃恒溫箱，烘烤30 min。然后按照“二甲苯10 min×2→100％酒精5 min→95％酒精5 min→75％酒精5 min→70％酒精5 min”的流程浸泡。(2)抗體孵育: PBS清洗3次，每次5 min，滴加適量一抗，4℃過(guò)夜;抗體以5％的脫脂牛奶稀釋，SAB1411908、HPA045377的最佳工作濃度分1∶2 000、1∶3 000;37℃復(fù)溫45 min，PBS清洗，滴加適量二抗，28℃孵育90～120 min; Ab150105、Ab150077的最佳工作濃度均為1∶2 500。(3)顯色和鏡檢: PBS清洗，DAB顯色5 min; PBS清洗，蘇木精復(fù)染2 min;鹽酸酒精分化后，再行常規(guī)脫水、透明流程，并采用中性樹膠封片鏡檢。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1陽(yáng)性表達(dá)率顯微鏡下可見(jiàn)MAGE-A9和MAGE-A11蛋白在胞質(zhì)和胞核中均有表達(dá)，觀察著色程度和著色比例。著色程度:無(wú)色0分;淡黃色1 分;棕黃色2分;褐色3分。著色比例:著色細(xì)胞數(shù)不足5.0％ 0分; 5.0～10％ 1分; 11～20％ 2分; 21～50％ 3分;＞50％ 4分。著色程度+著色比例＞2者為陽(yáng)性表達(dá)病例，計(jì)入陽(yáng)性表達(dá)率［4］。

1.4.2陽(yáng)性表達(dá)量拍照，采用圖像分析軟件Image-pro plus，測(cè)量各樣品組織光密度值，作為其陽(yáng)性表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，陽(yáng)性表達(dá)量用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較行兩獨(dú)立分組的t檢驗(yàn);陽(yáng)性表達(dá)率以百分比表示，采用四格表確切概率法分析;相關(guān)性分析采用簡(jiǎn)單線性回歸; P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001表示差異極有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MAGE-A9和MAGE-A11的表達(dá)

MAGE-A9在正常組織中無(wú)表達(dá)，在乳腺良性瘤和乳腺癌的陽(yáng)性表達(dá)率分別為15.2％和54.5％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，平均表達(dá)水平分別為0.086±0.014、1.865±0.204，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001); MAGE-A11在正常組織及良性瘤中均無(wú)表達(dá)，僅在乳腺癌中表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)78.8％，見(jiàn)表1和圖1。

表1　兩組患者M(jìn)AGE-A9和MAGE-A11的表達(dá)情況

圖1　各組患者M(jìn)AGE-A9和MAGE-A11的免疫組化染色圖像（400×）

2.2MAGE-A9和MAGE-A11表達(dá)乳腺癌病理特征的關(guān)系

MAGE-A9和MAGE-A11表達(dá)與乳腺癌患者的年齡、腫瘤體積、病理類型、臨床分期、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移及PR均無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。MAGE-A9表達(dá)受到組織學(xué)分級(jí)、ER、HER-2的影響，組織學(xué)分級(jí)為Ⅲ級(jí)患者明顯高于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)，ER、HER-2陽(yáng)性患者明顯高于陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MAGE-A11表達(dá)僅受到ER、HER-2的影響，ER、HER-2陽(yáng)性患者明顯高于陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.3MAGE-A9和MAGE-A11表達(dá)的相關(guān)性分析

經(jīng)簡(jiǎn)單線性回歸分析，MAGE-A9和MAGE-A11表達(dá)水平呈直線正相關(guān)性(y = 0.798 1x + 1.278; R2=0.694 8)，見(jiàn)圖2。

圖2　MAGE-A9和MAGE-A11表達(dá)的相關(guān)直線

3　結(jié)論

根據(jù)表達(dá)特異性和基因結(jié)構(gòu)的差異，MAGE家族可分為MAGE-Ⅰ和MAGE-Ⅱ兩類。前者定位于特定的X染色體，多表達(dá)于睪丸、胎盤及部分腫瘤組織，與多種腫瘤性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān);后者在X染色體則沒(méi)有明確的定位，多表達(dá)于神經(jīng)組織，與腫瘤沒(méi)有明確關(guān)聯(lián)［5］。MAGE-A基因亞家族屬于MAGE-Ⅰ，現(xiàn)已發(fā)12名成員(MAGE-A1～MAGE-A12)，是當(dāng)前腫瘤免疫療法的研究重點(diǎn)。研究表明［6］，除睪丸、胎盤等“免疫豁免”器官外，MAGE-A在正常人體組織中幾乎不表達(dá)，且多數(shù)腫瘤組織至少表達(dá)一種MAGE-A亞型。然而，不同的MAGE-A基因亞型在不同腫瘤具有不同的表達(dá)特點(diǎn)，如MAGE-A1高表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤而低表達(dá)于卵巢癌［7］。MAGE-A9和MAGE-A11對(duì)乳腺癌臨床診治是否有研究?jī)r(jià)值，目前尚無(wú)明確報(bào)道。

表2　乳腺癌患者M(jìn)AGE-A9和MAGE-A11表達(dá)與病理特征的關(guān)系(±s)

表2　乳腺癌患者M(jìn)AGE-A9和MAGE-A11表達(dá)與病理特征的關(guān)系(±s)

病理特征MAGE-A9(n =18)表達(dá)水平　F或t，P值MAGE-A11(n =26))表達(dá)水平　F或t，P值年齡＜40歲　1.825±0.173 40～50歲　1.866±0.185 ＞50歲　1.876±0.196 1.084，0.137 1.979±0.154 2.012±0.185 2.008±0.163 1.126，0.114病理類型導(dǎo)管癌　1.816±0.201小葉癌　1.873±0.183髓樣癌　1.853±0.174粘液癌　1.863±0.155 1.132，0.097 2.026±0.169 2.035±0.178 1.983±0.156 2.044±0.173 1.227，0.086腫瘤體積＜3 cm3　1.825±0.214 3～5 cm3　1.866±0.193 ＞5 cm3　1.886±0.203 1.007，0.152 2.005±0.157 2.007±0.187 1.998±0.146 0.931，0.207 TNM分期Ⅰ期　1.837±0.173Ⅱ期　1.863±0.185Ⅲ期　1.886±0.196 1.228，0.086 1.983±0.168 2.003±0.174 2.006±0.175 0.954，0.195組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)　1.802±0.171Ⅱ級(jí)　1.851±0.173Ⅲ級(jí)　1.985±0.203 1.986，0.021 1.986±0.155 1.994±0.163 2.011±0.166 1.337，0.095分化程度高分化　1.903±0.186中分化　1.866±0.175低分化　1.853±0.183 1.427，0.077 2.016±0.175 2.007±0.163 2.001±0.166 1.406，0.080 ER陽(yáng)性　2.135±0.221陰性　1.625±0.161 6.214，0.000 2.133±0.183 1.856±0.167 4.317，0.000 HER-2陽(yáng)性　1.936±0.193陰性　1.753±0.187 3.102，0.001 2.203±0.195 1.922±0.188 3.428，0.000 PR陽(yáng)性　1.853±0.175陰性　1.872±0.186 1.382，0.083 2.012±0.153 1.997±0.168 1.503，0.071

本研究對(duì)MAGE-A9和MAGE-A11在乳腺正常組織、乳腺良性瘤及乳腺癌組織中的表達(dá)趨勢(shì)進(jìn)行初步測(cè)定，并分析其表達(dá)水平與乳腺癌病理特征的相關(guān)性，以初步探索兩指標(biāo)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的臨床意義。研究結(jié)果顯示，MAGE-A9在正常組織中無(wú)表達(dá)，在乳腺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)水平明顯高于良性瘤組織，分別為54.5％和15.2％; MAGE-A11在正常組織及良性瘤組織中均無(wú)表達(dá)，乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)78.8％。受研究方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的影響，該結(jié)果與其他研究有些許出入，如侯淑蕓等［4］以PCR手段測(cè)得乳腺癌患者M(jìn)AGE-A9 和MAGE-A11陽(yáng)性表達(dá)率分別為45％和66.7％，連易水等［8］以免疫組織化學(xué)方法測(cè)得乳腺癌患者的MAGE-A11陽(yáng)性表達(dá)率為51.7％。但各研究結(jié)果均顯示癌旁正常組織MAGE-A9和MAGE-A11表達(dá)陰性，與本研究結(jié)果具有高度一致性，同時(shí)也證明兩者與乳腺腫瘤性疾病的關(guān)系極為密切。

此外，本研究進(jìn)一步分析MAGE-A9和MAGEA11表達(dá)水平與乳腺癌患者病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示MAGE-A9表達(dá)受組織學(xué)分級(jí)、ER、HER-2的影響，組織學(xué)Ⅲ級(jí)患者明顯高于Ⅰ、Ⅱ級(jí)，ER、HER-2陽(yáng)性高于陰性; MAGE-A11表達(dá)僅受到ER、HER-2的影響，ER、HER-2陽(yáng)性高于陰性。實(shí)質(zhì)上，既往學(xué)者對(duì)乳腺癌患者的組織學(xué)分級(jí)、ER、HER-2表達(dá)特點(diǎn)及其重要意義均做過(guò)研究。組織學(xué)分級(jí)主要反映癌組織的惡性程度，是預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)，長(zhǎng)期實(shí)踐證明，乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)越高，惡性程度越高、細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)，預(yù)后越差［9］。激素受體表達(dá)情況也是乳腺癌患者臨床診治和預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)，研究表明［10］，ER和PR均參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，可作為乳腺癌臨床內(nèi)分泌治療方案的參考依據(jù)，亦可作為典型預(yù)后標(biāo)志物。同時(shí)，Xia等指出［11］，HER-2高表達(dá)是乳腺癌預(yù)后不良的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。國(guó)內(nèi)學(xué)者王寧等［12］針對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌患者的HER-2表達(dá)情況與組織病理學(xué)分級(jí)做了相關(guān)性考察，結(jié)果證實(shí)HER-2陽(yáng)性表達(dá)患者的組織學(xué)分級(jí)明顯高于陰性。本研究結(jié)果中MAGEA9、MAGE-A11表達(dá)水平與PR表達(dá)情況均未表現(xiàn)出相關(guān)性，而與ER、HER-2表達(dá)情況相關(guān)，故而筆者推測(cè)MAGE-A9和MAGE-A11可能重點(diǎn)參與ER依賴性乳腺癌的細(xì)胞增殖，而受PR影響不大;然而，本實(shí)驗(yàn)病例數(shù)較少，該結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

總而言之，MAGE-A9和MAGE-A11與乳腺癌患者病理特征的關(guān)系說(shuō)明兩者均可為乳腺癌提供新的治療方案，并有望成為其臨床診斷和預(yù)后評(píng)估的輔助指標(biāo)。

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(學(xué)術(shù)編輯:何朗)

Expression and significance of the tumor antigen MAGE-A9 and MAGEA11 in breast cancer

LI Jun-jun，HE Yan，HU Xiao-bo，OUYANG Li-zhi

(Department of Pathology，Hunan Cancer Hospital，Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine，Central South University，Changsha 4100013，Hunan，China)

【Abstract】Objective: To analyze the expression difference of melanoma associated antigen subtypes MAGE-A9 and MAGEA11 in breast normal tissue，breast benign tumor and breast cancer，so as to search new targets for the clinical diagnosis and treatment of breast cancer.Methods:33 patients with breast normal tissue and 33 patients with breast cancer accepted in our hospital and treated with surgery were selected，and both the pathological tissue and the healthy tissue around were prepared paraffin slice.The MAGE-A9 and MAGE-A11 expression level were detected by immunohistochemical experiment，which relationship to pathological features were analyzed.Results: The MAGE-A9 had no expression in healthy tissue，and its expression rate in breast benign tumor and breast cancer accounted for 15.2％ and 54.5％，which has statistical differences (P＜0.05).The MAGE-A11 had no expression in both healthy tissue and breast benign tumor，and its expression rate in breast cancer accounted for 78.8％.The MAGE-A9 expression was affected by histological grade and ER/HER-2，and those in GradeⅢand ER/HER-2 positive were higher that the others (P＜0.05).The MAGE-A11 expression was affected by ER/HER-2 only，and those in ER/HER-2 positive were higher than negative，the difference was statistically significant (P＜0.05).MAGE-A9 and MAGE-A11 is expected to become the new targets for clinical diagnosis of breast cancer and tumor immunotherapy.Linear regression analysis results showed that the MAGE-A9 and MAGE-A11 expression level had positive linear correlation (y =0.798 1x +1.278; R2= 0.694 8).Conclusion: MAGE-A9 and MAGE-A11 is expected to become the new targets forbook=382,ebook=115clinical diagnosis and tumor immunotherapy of breast cancer.

【Key words】MAGE-A9; MAGE-A11; Breast cancer

作者簡(jiǎn)介:李俊軍(1973-)，男，湖南嘉禾人，副主任醫(yī)師，主要從事乳腺腫瘤方面的研究。E-mail:494427973@qq.com

收稿日期:2015-01-26

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.03.27

【文章編號(hào)】1005-3697(2015)03-0381-05

【中圖分類號(hào)】R737.9; R36

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2015-6-19 17∶39網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150619.1739.025.html