原兒茶酸對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

覃華1，張琰1，杜小燕1，崔穎2，王茹1*

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，西安 710038； 2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院輸血科，西安 710038)

摘要：目的研究原兒茶酸對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷的保護(hù)作用。方法采用結(jié)扎SD大鼠冠狀動(dòng)脈建立MI/R (30 min/3 h)損傷模型，將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、原兒茶酸組(低、中、高劑量)、丹參多酚酸鹽6組。除模型組于再灌注時(shí)給予生理鹽水外，原兒茶酸低、中、高劑量組及丹參多酚酸鹽組于再灌注即刻給予原兒茶酸(5，10和20 mg·kg-1)及丹參多酚酸鹽(20 mg·kg-1)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)心功能，實(shí)驗(yàn)?zāi)y(cè)定心肌梗死面積，并檢測(cè)血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白(cTnI)水平。結(jié)果與模型組相比，原兒茶酸中、高劑量組大鼠心功能得以改善(P<0.05)，心肌梗死面積顯著減少(P<0.05)，血清中心肌損傷酶CK-MB、cTnI的水平顯著下降(P<0.05)。結(jié)論原兒茶酸對(duì)大鼠MI/R損傷具有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：原兒茶酸；心肌缺血/再灌注；心功能；心肌梗死

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.016

中圖分類號(hào)：R965文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)

作者簡(jiǎn)介：覃華，女，主管藥師

收稿日期：(2015-03-02)

Protective effect of protocatechuic acid on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats

QIN Hua1，ZHANG Yan1，DU Xiaoyan1，CUI Ying2，WANG Ru1*(1.Department of Pharmacy，Tangdu Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710038，China；2.Department of Blood Transfusion, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710038，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protection effect of protocatechuic acid on myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury in rats. Methods The rats were subjected to MI/R (30 min/3 h) by occluding the left anterior descending artery. The rats randomly received one of the following treatments intravenously and were randomly divided into six groups: sham group，model group，protocatechuic acid group (low，middle and high doses) and salvianolate group. Sham-operated control rats (sham) underwent the same surgical procedures with the exception of left anterior descending coronary artery occlusion. Protocatechuic acid and salvianolate groups were treated with the dose of 5，10 and 20 mg·kg-1 of protocatechuic acid and 20 mg·kg-1 of salvianolate， respectively. The change of cardiac function was monitored by multi-channel physiology recorder. The area of myocardial infarction and the levels of CK-MB，cTnI in serum were determined to evaluate the protection effect of protocatechuic acid. Results Compared with the model group，the cardiac function of MI/R rats was improved(P<0.05)，the infarct area and the levels of creatine kinase-MB (CK-MB) and cardiac troponin (cTnI) in the middle and high dose of protocatechuic acid groups were significantly decreased (P<0.05).ConclusionProtocatechuic acid has excellent cardioprotective effects against MI/R injury in rats.

Key words: protocatechuic acid；myocardial ischemia/reperfusion；cardiac function； myocardial infarction

*通信作者：王茹，女，副主任藥師

冠狀動(dòng)脈性心臟病(coronary artery heart disease，CAHD，簡(jiǎn)稱冠心病)對(duì)生命和健康的威脅很大，是當(dāng)今造成人類死亡的頭號(hào)殺手。臨床上冠脈支架、溶栓及搭橋血管重建術(shù)等已成為傳統(tǒng)的治療方法，但在心臟血運(yùn)重建過(guò)程中反而出現(xiàn)比心肌缺血更明顯、更嚴(yán)重的損傷和功能障礙，稱為再灌注損傷。目前，關(guān)于心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷領(lǐng)域的研究已經(jīng)受到醫(yī)藥學(xué)家的高度關(guān)注，探討如何減輕MI/R損傷是研究的熱點(diǎn)[1-2]。中藥治療MI/R損傷療效確切、前景良好[3]，其中丹參(Salviamiltiorrhizae)心肌保護(hù)作用的研究最為引人關(guān)注。丹參早已被廣泛應(yīng)用于治療冠心病、腦卒中、動(dòng)脈粥樣硬化等[4-6]。早在90年代，W. Zhou等的研究表明：丹參水溶性成分在大鼠離體心臟上具有防治MI/R損傷的保護(hù)作用[7]。同時(shí)，游勇基等通過(guò)高效液相色譜法，測(cè)定丹參中4種主要的水溶性成分：丹酚酸B(salvianolic acid B)、丹參素(danshensu)、原兒茶醛(protocatechuic aldehyde)、原兒茶酸(protocatechuic acid)[8]，但迄今為止原兒茶酸防治MI/R損傷的研究卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈模擬MI/R損傷模型，探究原兒茶酸是否具有抗MI/R損傷的作用。

1儀器與試藥

1.1儀器RM-4200多道生理記錄和分析處理系統(tǒng),由成都儀器廠提供。

1.2試劑原兒茶酸(protocatechuic acid)由南京替斯艾么中藥研究所提供；注射用丹參多酚酸鹽(Salvia miltiorrhiza polyphenols acid salt，SMPAS)由上海綠谷制藥有限公司提供；肌酸激酶同工酶(CK-MB)，肌鈣蛋白(cTnI)由上海西唐生物科技有限公司提供；2，3，5-氯化三苯基四氮唑藍(lán)(TTC)染色劑由中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司提供；伊文思藍(lán)(EB)由美國(guó)Sigma-Aldrich公司提供。

1.3動(dòng)物SD雄性大鼠48只，清潔級(jí)，鼠齡3個(gè)月，質(zhì)量250～300 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(軍)2007-007。

2方法

2.1MI/R模型使用30 g·L-1的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉SD大鼠后，接RM-4200多道生理記錄監(jiān)測(cè)心電變化。氣管插管之后，接小動(dòng)物呼吸機(jī)。分離氣管后經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管至左心室，記錄左室壓及其微分。于左側(cè)第3～4肋骨間打開胸腔，暴漏心臟后，在左冠狀動(dòng)脈前降支起始2 mm處進(jìn)針，待呼吸、血壓平穩(wěn)后用5～0號(hào)無(wú)損傷縫合線穿過(guò)心肌層結(jié)扎，結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌顏色發(fā)紺。缺血60 min后解除結(jié)扎再灌注3 h。以心電圖ST段抬高為結(jié)扎成功[9]。

2.2實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)SD大鼠分為6組，分別是假手術(shù)組、模型組和原兒茶酸組及陽(yáng)性對(duì)照丹參多酚酸鹽組。在原兒茶酸組中分為3個(gè)劑量組，分別是5，10和20 mg·kg-1，假手術(shù)組只進(jìn)行穿線不結(jié)扎；模型組于頸靜脈給予生理鹽水；原兒茶酸組及丹參多酚酸鹽組于頸靜脈給予原兒茶酸和丹參多酚酸鹽。給藥時(shí)間均為再灌注之前給藥。

2.3測(cè)定指標(biāo)

2.3.1心臟功能監(jiān)測(cè)通過(guò)多導(dǎo)生理記錄儀(RM-4200)持續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、收縮壓最大上升速率(+dp/dtmax)、舒張壓最大下降速率(-dp/dtmax)、心率(HR)等心功能指標(biāo)。

2.3.2心肌梗死面積測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸靜脈注射伊文思藍(lán)EB(5 mg·kg-1)2 mL，30 min后打開胸腔，取出心臟，生理鹽水充分洗凈殘血，濾紙吸干，剪去血管、結(jié)締組織、心房和右心室，留下左心室。將左心室置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min，平行房室溝將其切成5～8 片，每片厚1～2 mm。切片置于10 g·L-12，3，5-氯化三苯基四氮唑藍(lán)(TTC)中,37 ℃孵育15 min，隨后用多聚甲醛固定，正常心肌組織染成藍(lán)色，缺血心肌組織染成紅色，梗死心肌組織為白色。將切片展開平鋪于載玻片上，采用數(shù)碼相機(jī)拍攝，導(dǎo)出的照片利用圖像分析軟件Image ProPlus計(jì)算梗死面積[10]。

2.3.3血清生化指標(biāo)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從SD大鼠頸動(dòng)脈取血，室溫靜置20 min，3 500 r·min-1離心12 min,取血清，按照試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作檢測(cè)CK-MB和cTnI水平。

3結(jié)果

3.1大鼠心功能的變化再灌注60和120 min大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax及HR的變化如表1所示。研究發(fā)現(xiàn)在灌注時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax及HR均降低(P<0.05)。原兒茶酸組20 mg·kg-1及丹參多酚酸鹽組，以上參數(shù)較模型組均升高(P<0.05)。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1原兒茶酸對(duì)MI/R損傷大鼠心功能的影響

Tab.1Effect of protocatechuic acid on cardiac function against MI/R injury in rats

± s, n=8)

注：與假手術(shù)組比較#P< 0.05；與模型組比較*P< 0.05。

3.2大鼠心肌梗死面積的變化伊文思藍(lán)及TTC染色的心臟切片見(jiàn)圖1。與模型組比較，原兒茶酸組的大鼠心肌梗死面積減少(P<0.05)。尤其是20 mg·kg-1組，梗死面積顯著下降，但與丹參多酚酸鹽組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1TTC染色后心肌組織的典型圖片

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.原兒茶酸 (5 mg·kg-1)組；D.原兒茶酸(10 mg·kg-1)組；E.原兒茶酸(20 mg·kg-1)組；F.丹參多酚酸鹽組

Fig.1 Representative photographs of heart tissues taken from rats after TTC staining

A.sham operation group；B.model group;C.the model group of protocatechuic acid group(5 mg·kg-1);D.the model group of protocatechuic acid group(10 mg·kg-1);E.the model group of protocatechuic acid group(20 mg·kg-1);F.Salviamiltiorrhizagroup

表2原兒茶酸對(duì)MI/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響

Tab.2Effect of protocatechuic acid on myocardial infarct area against MI/R injury in rats

± s, n=8)

注：與假手術(shù)組比較#P<0.05；與模型組比較*P< 0.05。

3.3大鼠血清中CK-MB和cTnI水平的變化血清中心肌酶CK-MB和cTnI的水平見(jiàn)表3。與假手術(shù)組相比，模型組血清中CK-MB和cTnI的水平顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，原兒茶酸組以上心肌酶水平降低。尤其是10和20 mg·kg-1劑量組，CK-MB和cTnI水平下降顯著(P<0.05)。

表3原兒茶酸對(duì)MI/R損傷大鼠血清中CK-MB，cTnI水平的影響

Tab.3 Effect of protocatechuic acid on the levels of CK-MB，cTnI in serum against MI/R injury in rats

± s, n=8)

注：與假手術(shù)組比較#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

4討論

近年來(lái)，中醫(yī)藥對(duì)MI/R損傷的治療作用日趨重視，其中丹參的治療效果最引人關(guān)注[7]。其化學(xué)成分主要為水溶性成分和脂溶性成分兩部分。眾所周知，傳統(tǒng)中藥在使用時(shí)多用其水煎成分，因而近年來(lái)關(guān)于丹參水溶性成分的研究較多[11]。有報(bào)道認(rèn)為丹參素作為丹參的主要水溶性成分，在SI/R(simulated ischemia/reperfusion)損傷的H9c2心肌細(xì)胞上，通過(guò)激活PI3K/Akt、ERK1/2信號(hào)通路發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用[12]。另一種水溶性成分丹酚酸A被報(bào)道在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均具有防治MI/R損傷的保護(hù)作用[13]。然而，作為丹參中主要的水溶性成分之一的原兒茶酸關(guān)于防治MI/R損傷的作用卻尚未報(bào)道。

現(xiàn)代研究表明，氧化應(yīng)激、鈣超載、白細(xì)胞激活以及能量代謝障礙等是引起MI/R損傷的主要因素，其中導(dǎo)致?lián)p傷最嚴(yán)重、時(shí)程最長(zhǎng)的因素為氧化應(yīng)激[14]。原兒茶酸的相對(duì)分子質(zhì)量?jī)H154 g/mol，為小分子化合物。化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有一對(duì)鄰二酚羥基，具有氧自由基清除作用。

本研究通過(guò)檢測(cè)心功能、心肌梗死面積及心肌損傷酶等指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)原兒茶酸在大鼠MI/R模型上的治療作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心功能的變化與心肌MI/R損傷的程度密切相關(guān)，心臟的工作性能主要取決于心室肌的收縮和舒張性能[15]。本研究結(jié)果顯示，MI/R后大鼠LVEDP明顯升高，LVSP、+dp/dtmax明顯降低，即心臟發(fā)生靜脈張力升高，張力降低，心肌收縮功能下降。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸可不同程度地改善MI/R損傷引起的心臟舒縮功能障礙。心肌梗死面積與心功能密切相關(guān)，在臨床上對(duì)預(yù)后和評(píng)價(jià)治療效果都具有重要意義。梗死面積的衡量也被認(rèn)為是評(píng)價(jià)MI/R損傷的標(biāo)準(zhǔn)之一[16]。本研究通過(guò)TTC染色后測(cè)定大鼠心肌梗死面積，發(fā)現(xiàn)原兒茶酸可以減少M(fèi)I/R損傷的心肌梗死面積。同時(shí)，在心肌MI/R損傷時(shí)能引起受損心肌細(xì)胞心肌酶的釋放。臨床上特異性的心肌酶也被認(rèn)為是MI/R損傷診斷的重要指標(biāo)。其中cTnI和CK-MB通常被認(rèn)為是急性心肌損傷的標(biāo)志物[17]。通過(guò)檢測(cè)以上心肌酶。我們發(fā)現(xiàn)MI/R損傷大鼠血清中的cTnI和CK-MB的水平升高，而原兒茶酸能夠降低血清中以上2種心肌酶的水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)原兒茶酸能夠改善MI/R損傷時(shí)的心功能，減小心肌梗死面積，同時(shí)降低血清中標(biāo)志性的心肌酶cTnI和CK-MB的釋放，效果不劣于陽(yáng)性對(duì)照藥丹參多酚酸鹽，證實(shí)原兒茶酸具有防治MI/R損傷的作用，但具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]紀(jì)偉寧，楊毅寧.心肌缺血-再灌注損傷治療新進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2011，32(3):432-435.

[2]李偉，沈明勤，陸曉暉.中藥防治心肌缺血再灌注損傷作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(3):549-553.

[3]新華·那比，艾尼瓦爾，周承明，等.赤土茯苓苷對(duì)離體大鼠心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].西北藥學(xué)雜志，2000，15(3):110-112.

[4]張卓然，李鴻珠，高君，等.丹參注射液抑制大鼠心肌缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37(4):14-17.

[5]吳波，劉鳴.丹參類藥物治療急性缺血性腦卒中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2004，8(10):1925-1927.

[6]劉紅.丹參對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔血清一氧化氮、血漿內(nèi)皮素和脂質(zhì)過(guò)氧化物的影響[J]. 湖北中醫(yī)雜志，2001，23(8):11.

[7]Zhou W，Ruigrok T J. Protective effect of danshen during myocardial ischemia and reperfusion: an isolated rat heart study[J]. Am J Chin Med， 1990，18(1/2):19-24.

[8]游勇基，程廣強(qiáng)，陳銘輝.丹參注射劑中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B 的同時(shí)測(cè)定[J].藥物分析雜志，2004，24(1): 46-49.

[9]Zhu J，Qiu Y，Wang Q，et al. Low dose cyclophosphamide rescues myocardial function from ischemia-reperfusion in rats[J].Eur J Cardiothorac Surg，2008，34(3):661-666.

[10]Gao F，Tao L，Yan W，et al. Early anti-apoptosis treatment reduces myocardial infarct size after a prolonged reperfusion[J]. Apoptosis，2004，9(5):553-559.

[11]李驊，王四旺，張邦樂(lè)，等.丹參素的藥理活性與藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2011，26(4):310-312.

[12]Yin Y，Guan Y，Duan J，et al.Cardioprotective effect of danshensu against myocardial ischemia/reperfusion injury and inhibits apoptosis of H9c2 cardiomyocytes via Akt and ERK1/2 phosphorylation[J]. Eur J Pharmacol，2013，699(1-3):219-226.

[13]Fan H，Yang L，F(xiàn)u F，et al. Cardioprotective effects of salvianolic acid A on myocardial ischemia-reperfusion injuryinvivoandinvitro[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012:508938.

[14]Kaminski K，Bonda T，Wojtkowska I，et al. Oxidative stress and antioxidative defense parameters early after reperfusion therapy for acute myocardial infarction[J]. Acute Card Care，2008，10(2):121-126.

[15]王振富.參附注射液對(duì)心肌缺血/再灌注損傷血流動(dòng)力學(xué)和心肌酶的影響[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2011，27(2):155-157.

[16]Friedrich M G，Abdel-Aty H，Taylor A，et al. The salv-

aged area at risk in reperfused acute myocardial infarction as visualized by cardiovascular magnetic resonance[J]. J Am Coll Cardiol，2008，51(16):1581-1587.

[17]唐學(xué)靜，吳娛，林明.肌鈣蛋白I，CK，CK-MB 的測(cè)定在心肌損傷性疾病中的診斷價(jià)值[J].大連大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(6): 60-62.