·論著·

HIF-1α@Fe3O4納米顆粒標記對胰腺癌干細胞增殖及凋亡的影響

謝曉東朱海濤吳熒熒黃文斯王穎吳愷迪張禮榮王冬青

【摘要】目的探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α螯合四氧化三鐵(HIF-1α@Fe3O4)納米顆粒標記胰腺癌干細胞的可行性，并觀察胰腺癌干細胞被標記后的增殖及凋亡變化。方法采用無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)胰腺癌細胞株P(guān)ANC1干細胞，將獲得的干細胞與5、15、45、135 μg/ml的HIF-1α@Fe3O4納米顆粒共孵育24 h，采用普魯士藍染色法觀察胰腺癌干細胞的標記率，采用四甲基偶氮唑藍比色法檢測胰腺癌干細胞的增殖活性，采用流式細胞儀檢測胰腺癌干細胞的凋亡。結(jié)果HIF-1α@Fe3O4納米顆粒與胰腺癌干細胞共培養(yǎng)24 h后的胞質(zhì)內(nèi)可見不同程度的藍色鐵染顆粒，且隨著HIF-1α@Fe3O4濃度的增加而增加，濃度為45 μg/ml時標記率達100%。未標記的干細胞及5、15、45、135 μg/ml HIF-1α@Fe3O4標記的胰腺癌干細胞的細胞凋亡率分別為(3.76±0.96)%、(4.38±0.84)%、(4.36±1.22)%、(3.80±0.11)%、(4.78±0.98)%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；未標記的干細胞與各濃度納米顆粒標記的干細胞細胞存活率的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論HIF-1α@Fe3O4納米顆粒可用于標記胰腺癌干細胞，且不影響胰腺癌干細胞的增殖及凋亡。

【關(guān)鍵詞】胰腺腫瘤；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；四氧化三鐵；干細胞；細胞增殖；細胞凋亡

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.01.006

基金項目：江蘇省自然基金(BK2011487)；鎮(zhèn)江市社會發(fā)展項目(SH2013026)；江蘇大學(xué)大學(xué)生科研立項資助項目(12A209)

收稿日期：(2014-09-16)

Effect of HIF-1α@Fe3O4nanoparticles tag on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer stem cellsXieXiaodong,ZhuHaitao,WuYingying,HuangWensi,WangYing,WuKaidi,ZhangLirong,WangDongqing.DepartmentofRadiology,AffiliatedHospitalofSuzhouUniversity,Zhenjiang212001,China

Correspondingauthor:ZhuHaitao,Email：zhht25@163.com

Abstract【】ObjectiveTo explore the feasibility of HIF-1α@Fe3O4 nanoparticles tag of pancreatic cancer stem cells, and to investigate the proliferation and apoptosis rate of the labeled pancreatic cancer stem cells. MethodsPANC1 pancreatic cancer stem cells were cultured in serum-free medium, and then the pancreatic cancer stem cells were co-cultured with different concentrations of HIF-1α@Fe3O4(5 、15、45 、135 μg/ml) for 24 h. Prussian blue staining method was used to determine the labeling efficiency. MTT method was used to analyze the proliferation of pancreatic cancer stem cells. Also, flow cytometry was used to evaluate apoptosis. ResultsPrussian blue staining showed various number of blue-stained iron particles in the cells after co-culture of HIF-1α@Fe3O4 nanoparticles and pancreatic cancer stem cells. And the number of blue-stained iron particles increased with the concentration of HIF-1α@Fe3O4, and the labeled rate reached 100% with the concentration of 45 μg/ml or above. The apoptosis rates of stem cells of 5, 15, 45, 135 μg/ml HIF-1α@Fe3O4 tag and stem cells of without tag were (4.38±0.84)%, (4.36±1.22)%, (3.8±0.11)%, (4.78±0.98)%, (3.76±0.96)%, and the difference between the two groups was not statistically significant (P>0.05); and the survival rates between the two groups was not statistically significant (P>0.05), either. ConclusionsHIF-1α@Fe3O4 nanoparticles can be used for tagging pancreatic cancer stem cells, and they do not affect the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer stem cells.

【Key words】Pancreatic neoplasms;Hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit;Ferrosoferric oxide;Stem cells;Cells proliferation;Apoptosis

作者單位：212001鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院影像科

通信作者：朱海濤，Email：zhht25@163.com

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)是在缺氧誘導(dǎo)的細胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)的，最先由Semenza等[1]報道。它是缺氧誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄和信息傳遞中最重要的因子，在調(diào)控有氧能量代謝、腫瘤血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移、細胞凋亡及放療和化療抵抗等生物學(xué)效應(yīng)中都發(fā)揮著重要作用[2-3]。磁共振成像(MRI)是一種無創(chuàng)、信號敏感和組織分辨率高的顯像方式，納米磁粒子Fe3O4因良好的生物相容性和MRI信號敏感性而常用于離體和活體的生物學(xué)研究[4]。本研究根據(jù)已知的HIF-1α可識別的核酸序列5′-RCGTG-3′設(shè)計、合成核酸序列，并使其螯合于納米磁粒子Fe3O4上合成HIF-1α@Fe3O4，用于探索該納米顆粒對胰腺癌干細胞標記的可行性以及對細胞增殖、凋亡的影響，為后期應(yīng)用于磁共振靶向成像及靶向治療奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、試劑及材料

胎牛血清(FBS)、細胞培養(yǎng)基DMEM/F12、培養(yǎng)基添加劑B27、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維母細胞生長因子(bFGF)、胰島素及轉(zhuǎn)鐵蛋白均購于美國Gibco公司。胰蛋白酶購于Amersco 公司。 二甲亞砜(DMSO)以及四甲基偶氮唑藍(MTT)購于Sigma 公司，Annexin V-PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司。HIF-1α螯合于納米磁粒子Fe3O4的合成物HIF-1α@Fe3O4由江蘇大學(xué)化工學(xué)院合成。胰腺癌細胞系PANC1購于中國科學(xué)院上海細胞研究所。

二、方法

1．胰腺癌干細胞培養(yǎng)：PANC1細胞常規(guī)培養(yǎng)、傳代。培養(yǎng)三代到細胞狀態(tài)穩(wěn)定后采取本課題組前期實驗采用的無血清培養(yǎng)方式，并在培養(yǎng)液中加入20 ng/ml EGF、20 ng/ml B27及bFGF、5 μg/ml胰島素、2.75 μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白等培養(yǎng)胰腺癌干細胞[5]。

2．HIF-1α@Fe3O4標記胰腺癌干細胞：收集胰腺癌干細胞，用培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×105/ml，接種于6孔板，每孔2 ml。4個孔中分別加入5、15、45、135 μg/ml的HIF-1α@Fe3O4納米顆粒，剩余2孔加入等體積的培養(yǎng)基作為對照，實驗設(shè)置3組6孔板。6孔板置培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出，棄培養(yǎng)上清，用預(yù)冷的PBS清洗3遍去除游離的HIF-1α@Fe3O4，再用4%戊二醛溶液固定細胞約20 min，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3遍，加入Perl試劑(2%亞鐵氰化鉀和6%鹽酸混合溶液)孵育30 min，用PBS再次清洗細胞3遍，最后用1%核固紅水溶液復(fù)染5 min，用蒸餾水洗去多余的核固紅，置顯微鏡下觀察，用Image J軟件分析圖片，結(jié)果以細胞內(nèi)顆粒數(shù)表示。

3．細胞增殖檢測：取上述標記的各組胰腺癌干細胞及未標記的胰腺癌干細胞制備成單個細胞懸液，接種于96孔板中，每孔200 μl，1×105個細胞，以只加培養(yǎng)基孔作為空白對照。置37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～6 d，每個時間點設(shè)3個復(fù)孔。到培養(yǎng)時間時在每孔中加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加入150 μl DMSO，置搖床振蕩10 min，上酶標儀檢測波長490 nm處的吸光度值(A490值)，以空白對照孔調(diào)零，繪制細胞生長曲線。

4．細胞凋亡測定：取標記的各組胰腺癌干細胞和未標記的胰腺癌干細胞，棄去上清，用3 ml預(yù)冷的PBS漂洗2次，將細胞重懸于預(yù)冷的70%乙醇中4℃固定1～2 h，離心棄去固定液，用3 ml PBS重懸細胞，400目篩網(wǎng)過濾、離心收集細胞，加含有1 μl PI和5 μl AnnexinV 的緩沖液，室溫下放置15 min，加400 μl的緩沖液混勻，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、HIF-1α@Fe3O4標記胰腺癌干細胞的效率

在無血清培養(yǎng)基條件下腫瘤細胞呈懸浮半貼壁的球形生長，細胞表面CD133高表達(圖1)。HIF-1α@Fe3O4納米顆粒與胰腺癌干細胞共培養(yǎng)24 h后，胞質(zhì)內(nèi)可見不同程度的藍色鐵染顆粒，且隨著HIF-1α@Fe3O4濃度的增加而增加。當(dāng)濃度為45 μg/ml HIF-1α@Fe3O4時，標記率達100%，而未標記的干細胞的胞質(zhì)內(nèi)未見藍色鐵染顆粒(圖2)。

圖1　無血清培養(yǎng)基條件下的胰腺癌干細胞　1A：細胞呈半貼壁的球形生長；1B：細胞表面CD 133高表達(免疫熒光　×200)

圖2　5(2A)、15(2B)、45(2C)、135 (2D)μg/ml HIF-1α@Fe 3O 4納米顆粒標記的胰腺癌干細胞

二、胰腺癌干細胞的增殖

隨著時間的增加，各濃度標記組干細胞的A490值均逐漸增加，同一時間點未標記組及各濃度標記組之間的A490值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為1.004、2.417、0.348、0.174、0.076、0.295，P值均>0.05)，表明HIF-1α@Fe3O4納米顆粒毒性較小，不影響干細胞的活力(圖3)。

三、胰腺癌干細胞的凋亡

未標記的胰腺癌干細胞及5、15、45、135 μg/ml HIF-1α@Fe3O4標記的胰腺癌干細胞早期及晚期的總細胞凋亡率分別為(3.76±0.96)%、(4.38±0.84)%、(4.36±1.22)%、(3.80±0.11)%、(4.78±0.98)%(圖4)，各組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.807，P>0.05)，表明 HIF-1α@Fe3O4納米顆粒不影響胰腺癌干細胞的正常凋亡。

討論

眾所周知，腫瘤干細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)方面起著決定性的作用[6-9]，因此對干細胞的監(jiān)測及檢測對于患者的治療及預(yù)后判斷有著至關(guān)重要的作用。Fe3O4納米粒子對MRI的顯像具有信號強度變化顯著及對人體無傷害的優(yōu)勢[10-12]，因此采用Fe3O4納米粒子標記干細胞，為其成像提供新的方法與思路。

圖3　不同濃度HIF-1α@Fe 3O 4納米顆粒標記的胰腺癌干細胞的生長曲線

圖4　未標記(4A)及5、15、45、135 μg/ml(4B～4E)HIF-1α@Fe 3O 4納米顆粒標記的胰腺癌干細胞的細胞凋亡率

HIF-1α是缺氧條件下的一種核心轉(zhuǎn)錄因子，參與多種腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄以及新生血管形成和轉(zhuǎn)移過程[13-14]，增強腫瘤細胞在缺氧條件下的生存能力。Zhong等[15]檢測了179例19種腫瘤標本的HIF-1α表達，結(jié)果顯示包括胰腺癌在內(nèi)的13種腫瘤的HIF-1α均有不同程度的表達，而在良性腫瘤和癌旁正常組織中則未見表達。Akakurat等[16]報道，在所選取的20種胰腺癌細胞株中均有HIF-1α表達。Semenza等[17]發(fā)現(xiàn)5′-RCGTG-3′是HIF-1α可識別的基因序列。由于HIF在腫瘤細胞中高表達，因此在納米磁粒子上修飾含有5′-RCGTG-3′核酸序列不僅可以與高表達HIF-1α的腫瘤細胞結(jié)合，更可以在磁共振上實時監(jiān)測腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展，為早期檢測和治療腫瘤提供了新的檢測方法和治療思路。

本研究結(jié)果顯示，HIF-1α@Fe3O4成功地標記到胰腺癌干細胞，細胞標記率隨HIF-1α@Fe3O4濃度的增加而增加。HIF-1α@Fe3O4標記后胰腺癌干細胞的增殖及凋亡均未受影響，為后期MRI檢測胰腺癌干細胞提供了實驗基礎(chǔ)。同時，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α識別的序列可設(shè)計出更加特異性結(jié)合的探針，以提高診斷的靈敏度和特異性。

參考文獻

[1]Semenza GL, Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via denovo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation[J]. Mol Cell Biol,1992, 12(12):5447-5454.

[2]Imai T, Horiuchi A, Wang C, et al. Hypoxia attenuates the expression of E-cadherin via up-regulation of SNAIL in ovarian carcinoma cells[J]. Am J Pathol, 2003, 163 (4): 1437-1447.

[3]Minoia C, Quero C, Asselti M, et al. Changes in angiogenesis and hypoxia-inducible factor-1 alpha protein expression in relapsed/refractory indolent non-Hodgkin lymphomas[J]. Br J Haematol, 2013, 163(5), 640-645.

[4]Zhou R, Acton PD, Ferrari VA, et al. Imaging stem cells implanted in infarcted myoeardium[J]. J Am Coll Cardiol, 2006,48(10)：2094-2106.

[5]Wang D, Zhu H, Zhu Y, et al. CD133(+)/CD44(+)/Oct4(+)/Nestin(+) stem-like cells isolated from Panc-1 cell line may contribute to multi-resistance and metastasis of pancreatic cancer[J]. Acta Histochem, 2013, 115(4):349-356.

[6]Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells[J]. Nature, 2001, 414 (6859): 105-111.

[7]Visvader JE, Lindeman GJ. Cancer stem cells in solid tumors: accumulating evidence and unresolved questions[J]. Nat Rev Cancer, 2008, 8(10):755-768.

[8]Dick JE. Stem cell concepts renew cancer research[J]. Blood, 2008, 112(13): 4793-4807.

[9]Vries RG, Huch M, Clevers H. Stem cells and cancer of the stomach and intestine[J]. Mol Oncol, 2010, 4(5):373-384.

[10]Zhang C, Xie X, Liang S, et al. Mono-dispersed high magnetic resonance sensitive magnetite nanocluster probe for detection of nascent tumors by magnetic resonance molecular imaging[J]. Nanomedicine,2012, 8(6): 996-1006.

[11]Chien LY, Hsiao JK, Hsu SC, et al. In vivo magnetic resonance imaging of cell tropism, trafficking mechanism, and therapeutic impact of human mesenchymal stem cells in a murine glioma model[J]. Biomaterials, 2011, 32(12): 3275-3284.

[12]Yang Y, Schumacher A, Yang Y, et al. Monitoring bone marrow-originated mesenchymal stem cell traffic to myocardial infarction sites using magnetic resonance imaging[J]. Magn Reson Med, 2011, 65(5):1430-1436.

[13]Couvelard A, O′Toole D, Leek R, et al. Expression of hypoxia-inducible factors is correlated with the presence of a fibrotic focus and angiogenesis in pancreatic ductal adenocarcinomas[J]. Histopathology, 2005,46(6): 668-676.

[14]汪必成，劉志蘇．缺氧誘導(dǎo)因子-1α在肝癌中的表達及其對腫瘤細胞周期的影響和臨床意義[J]．中華實驗外科雜志，2006，23(11)：1404-1405.

[15]Zhong H, De Marzo AM, Laughner E, et al. Overexpression of hypoxia-inducible factor l alpha in common human cancers and their metastases[J]. Cancer Res, 1999, 59(22): 5830-5835.

[16]Akakura N，Kobayashi M，Horiuchi I,et al. Constitutive expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha renders pancreatic cancer cells resistant to apoptosis induced by hypoxia and nutrient deprivation[J]．Cancer Res, 2001, 61(17):6548-6554.

[17]Semenza GL, Jiang BH, Leung SW, et al. Hypoxia response elements in the aldolase A, enolase 1, and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding sites for hypoxia-inducible factor 1[J].J Biol Chem, 1996, 271(51): 32529-32537.

(本文編輯：屠振興)