■李洪波 許小友 黃志偉 劉利曉 羅志忠

（駐馬店市畜牧局，河南駐馬店 463000）

恩諾沙星（Enrofloxacin）又名乙基環(huán)丙沙星，是第三代喹諾酮類（Quinolones，QNs）抗菌藥，具有抗菌譜廣、殺菌作用強(qiáng)、副作用小，與其他抗菌藥物交叉耐藥等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床[1]。但是不合理使用恩諾沙星導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加[2]，嚴(yán)重威脅人體健康。喹乙醇（Olaquindox）又名喹酰胺醇，屬于喹噁啉類藥物，是一類喹噁啉-1,4-二氧化物，能抗菌，促進(jìn)蛋白質(zhì)同化，增加瘦肉率而被廣泛使用[3]。但是毒理學(xué)研究表明，喹乙醇具有致癌、致畸等毒性[4]。飼料生產(chǎn)過程中非法添加和養(yǎng)殖者在養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用的現(xiàn)象時有發(fā)生，因此為保證動物飼料安全，進(jìn)而保障畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全，有必要建立恩諾沙星和喹乙醇檢測方法。目前，關(guān)于恩諾沙星和喹乙醇的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法分別都有報(bào)道[5-8]，但同時檢測恩諾沙星和喹乙醇的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析法未見報(bào)道。本文建立了同時檢測恩諾沙星和喹乙醇的超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法。該方法靈敏度高，選擇性好，為快速、嚴(yán)格地檢測監(jiān)管飼料中恩諾沙星和喹乙醇的違規(guī)使用和非法添加情況提供技術(shù)保障。

1 材料和方法

1.1 儀器

Acquit UPLC-Xevo TQ-S質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters公司）；3-30k臺式高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；TTLDCⅡ氮吹儀（北京同泰科技發(fā)展有限公司）；IKAMS3.Basic圓周振蕩器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；AG125電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；Waters Oasis HLB固相萃取柱（3CC/60 mg）。

1.2 試劑

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉均為分析純；試驗(yàn)用水為經(jīng)mili-Q凈化系統(tǒng)制備的去離子水；恩諾沙星、喹乙醇購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液：分別稱取檸檬酸12.9 g、磷酸氫二鈉10.9 g、乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 ml溶解，用1 mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0±0.5，加水稀釋至1 000 ml，即得。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制

分別精密稱取恩諾沙星和喹乙醇各約10 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成約1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。于-20℃下避光保存，然后用30%乙腈逐步稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取

稱取飼料試樣2.00 g（精確到0.01g），置于50 ml離心管內(nèi)，加1%甲酸-乙腈（20∶80，V/V）10 ml，渦旋混勻2 min，超聲10 min，10 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50 ml離心管內(nèi)。將余下部分重復(fù)提取一次，合并提取液。準(zhǔn)確量取提取液5ml于10 ml試管中，50℃氮?dú)獯抵良s1 ml，加入Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液2 ml，渦旋混勻1 min，為待凈化溶液。

1.4.2 樣品凈化

取HLB固相萃取柱，依次用3 ml甲醇和3 ml Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液活化。待凈化液全部過柱，依次用3 ml水和3 ml 5%甲醇淋洗，擠干。用3 ml甲醇洗脫，收集洗脫液，50℃氮?dú)獯蹈?，加? ml 30%乙腈水溶液溶解成凈化液，稀釋10倍后（取凈化液0.1 ml，加入30%乙腈水溶液0.9 ml），過0.22 μm濾膜后供超液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

1.5 方法

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流動相A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈；進(jìn)樣量：2 μl；梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測MRM；離子源溫度：150℃；霧化溫度：500℃；霧化器流速：1 000 L/Hr；錐孔氣流速：150 L/Hr；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；定性、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 恩諾沙星和喹乙醇定性、定量離子及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系

精密吸取200 μg/l的標(biāo)準(zhǔn)混合中間液0.025、0.05、0.10、0.20、0.50 ml于1.5 ml離心管中，分別加入0.1 ml空白凈化液，分別加入30%乙腈水溶液溶0.88、0.85、0.80、0.70、0.40 ml，渦旋混勻，從而配制成5、10、20、50、100 μg/l的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并依次上機(jī)，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見表3），可以看出7種化合物在5～100 μg/l范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.998 0以上。

表3 恩諾沙星和喹乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.2 檢測限和定量限

向空白飼料試樣中添加適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)處理上機(jī)。根據(jù)特征質(zhì)量色譜峰的信噪比S/N＞3為檢測限，S/N＞10為定量下限，檢測到恩諾沙星、喹乙醇的檢測限為0.05 mg/kg，定量下限為0.1 mg/kg。

2.3 方法的靈敏度和準(zhǔn)確度

分別在配合飼料、預(yù)混合飼料、濃縮飼料中添加0.1、0.2、0.5 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個濃度做5個平行，連續(xù)做3批，其平均回收率、批內(nèi)(批間)變異系數(shù)見表4、表5、表6。恩諾沙星的回收率在80%～90%之間，喹乙醇的回收率在70%～90%，批內(nèi)批間的相對偏差均小于20%。恩諾沙星和喹乙醇在空白配合飼料中空白色譜圖見圖1，空白配合飼料添加色譜圖見圖2。

表4 配合飼料中恩諾沙星和喹乙醇的回收率及RSD(n=5)

表5 預(yù)混合飼料中恩諾沙星和喹乙醇的回收率及RSD(n=5)

表6 濃縮飼料中恩諾沙星和喹乙醇的回收率及RSD(n=5)

該試驗(yàn)方法靈敏度較好，準(zhǔn)確度高，滿足《獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》的相關(guān)要求。

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件的優(yōu)化

恩諾沙星具有兩性基團(tuán)，屬于酸堿兩性化合物，在水溶液中以離子形式存在，通常選用酸性溶液作為流動相組成成分[9]。喹乙醇已有報(bào)道，采用甲醇-水和乙酸-乙腈作為流動相系統(tǒng)[10]。在使用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，粒徑1.7 μm)作為色譜柱條件下，分別嘗試了甲酸、乙酸、甲醇、乙腈多種配比流動相條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用0.1%甲酸-乙腈作為流動相能獲得較好的峰型和較高的響應(yīng)。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先分別將恩諾沙星（100 ng/ml）和喹乙醇（200 ng/ml）標(biāo)準(zhǔn)溶液流動注射進(jìn)樣，以正離子模式進(jìn)行一級質(zhì)譜圖掃描，發(fā)現(xiàn)這些藥物的[M+H]+峰均比較強(qiáng)，故選擇[M+H]+作為母離子。然后進(jìn)行子離子掃描，最終分別選擇響應(yīng)值較高的兩個子離子作為定性和定量離子，并優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使其相應(yīng)的響應(yīng)值達(dá)到最大。

3.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于飼料樣品中基質(zhì)成分比較復(fù)雜，油脂類成分含量高，提取目標(biāo)化合物帶有堿性基團(tuán)，故采用酸化有機(jī)提取溶液。經(jīng)過多次試驗(yàn)最終確定用1%甲酸-乙腈（20∶80，V/V）溶液作為提取液回收率最好。固相萃取柱的選擇對樣品溶液的凈化，進(jìn)而減輕基質(zhì)效應(yīng)至關(guān)重要。本文分別對MCX、PCX、C18和HLB固相萃取柱進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLB柱回收率較高，批內(nèi)變異系數(shù)相對較小，最終選擇HLB柱作為凈化柱。同時對淋洗條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用水和5%甲醇淋洗都有較大的基質(zhì)干擾，采用10%甲醇淋洗，恩諾沙星和喹乙醇的的回收率明顯降低；因此采用依次用水和5%甲醇淋洗，甲醇洗脫，最終得到了滿意的試驗(yàn)結(jié)果。

圖1 空白配合飼料恩諾沙星和喹乙醇特征離子質(zhì)量色譜圖

圖2 空白配合飼料中添加0.2 mg/kg的恩諾沙星和喹乙醇特征離子質(zhì)量色譜圖

由于不同種類的飼料其組成成分不同，導(dǎo)致樣品溶液的基質(zhì)不同，從而在儀器檢測過程中產(chǎn)生本不同的基質(zhì)效應(yīng)。本研究采用同種空白飼料做添加回收試驗(yàn)?zāi)艿玫綕M意結(jié)果，但不同種類空白飼料偏差較大。本研究將恩諾沙星和喹乙醇作為目標(biāo)化合物進(jìn)行試驗(yàn)探索，同時優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件、色譜條件和質(zhì)譜條件，從而建立了飼料中同時檢測恩諾沙星和喹乙醇的UPLC-MS/MS方法，并且其準(zhǔn)確度和靈敏度能滿足飼料檢測的需要。恩諾沙星和喹乙醇是喹諾酮類和喹噁啉類藥物的典型代表。該方法的建立為喹諾酮類和喹噁啉類更多藥物同時進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測的方法研究奠定基礎(chǔ)，具有一定的創(chuàng)新性和參考價值。