■張 怡 劉敬為 童應(yīng)凱

(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

當(dāng)今社會養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，但同時(shí)抗生素的大量運(yùn)用也存在諸多問題，抗生素使用時(shí)間過長容易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，抗生素會破壞腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，這時(shí)體外微生物就有可能入侵體內(nèi)造成交叉感染[1]。而微生物制劑能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道平衡，并且能抑制很多致病菌，并且有助于動(dòng)物腸道蠕動(dòng)，促進(jìn)消化，因此，動(dòng)物微生物制劑自然在畜牧業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用[2]。微生物制劑分為很多種，比如酵母菌、硝化細(xì)菌、芽孢桿菌、光合細(xì)菌、乳酸菌、EM菌等[3]，酵母菌做為非細(xì)菌性的益生菌的應(yīng)用時(shí)間已久，在一定的程度上酵母菌能夠?qū)λ拗鹘】涤蟹e極的影響[4]。布拉酵母菌作為微生態(tài)制劑的一種，可以預(yù)防抗生素造成的菌群失調(diào)[5]。布拉酵母菌對腸出血性大腸桿菌(EHEC)[6]與腸病原性大腸桿菌(EPEC)感染[7]有預(yù)防作用，并有可抑制燒傷患者患處細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)的作用[8]。凝結(jié)芽孢桿菌環(huán)境抗逆性強(qiáng)，能耐高溫、抗干燥、抗胃酸，并且易于存儲[9]。美國食品與藥物管理局(FDA)和美國飼料控制官員協(xié)會將其列入可用于飼料的安全微生物菌種名單[10]。固體發(fā)酵作為一種發(fā)酵方法，過程容易控制、能耗低、操作簡單、發(fā)酵產(chǎn)物高、對無菌要求相對較低、不易發(fā)生大面積污染[11]。本文通過將兩種菌進(jìn)行混合固體發(fā)酵，提高布拉酵母菌產(chǎn)量，進(jìn)一步提高兩種菌的益生效果。因此，本試驗(yàn)以測定生物量為目的，將布拉酵母菌和凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行混合固體培養(yǎng)優(yōu)化，得到較優(yōu)的培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

布拉酵母菌（Saccharomyces boulardii）、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)為天津農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

① 肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%，pH值為7.2～7.4，121℃ 滅菌20 min。

② 固體培養(yǎng)基底料：豆餅粉30%、麩皮30%、玉米粉40%，1∶1加水，121℃滅菌20 min。

③YEPD培養(yǎng)基：蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%，115℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 搖瓶液體菌種培養(yǎng)

將凝結(jié)芽孢桿菌接種于50 ml滅菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速為150 r/min，使其處于對數(shù)生長期(濃度為1×109～10×109CFU/ml)，培養(yǎng)18～24 h后，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將布拉酵母菌接種于50 ml滅菌YEPD培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床中,轉(zhuǎn)速為180 r/min，溫度為30℃，培養(yǎng)18 h后，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 添加化學(xué)試劑的布拉酵母菌與凝結(jié)芽孢桿菌混合固體發(fā)酵正交試驗(yàn)

為提高布拉酵母菌的生長數(shù)量，進(jìn)行正交試驗(yàn)，選取L9(34)正交表(正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1)。在裝有20 g固體培養(yǎng)基基料中，按正交試驗(yàn)表加入不同量營養(yǎng)物質(zhì)，滅菌，待培養(yǎng)基滅菌完冷卻后，加入2 ml的混合菌種子液（布拉酵母菌和凝結(jié)芽孢桿菌接種量都為5%），30℃培養(yǎng)48 h。

表1 布拉酵母菌與凝結(jié)芽孢桿菌混合固體發(fā)酵研究正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(%)

各試驗(yàn)組在30℃培養(yǎng)48 h后取出，每種樣品取1 g稀釋，用血球計(jì)數(shù)板法測量布拉酵母菌的數(shù)量。然后每種樣品再取1 g，稀釋到10-7涂布，37℃培養(yǎng)20～24 h，測量凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量。

1.2.3 最佳配方重復(fù)

布拉酵母菌和凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量測定后，用極差分析出最佳結(jié)果，選出最佳培養(yǎng)基。然后重復(fù)最佳添加劑配方試驗(yàn)，再次進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束測量布拉酵母菌的數(shù)量和凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 布拉酵母菌與凝結(jié)芽孢桿菌混合固體發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果（見表2）

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由于本試驗(yàn)以布拉酵母菌高產(chǎn)為最終目標(biāo)，所以觀測指標(biāo)是以布拉酵母菌數(shù)量為主。凝結(jié)芽孢桿菌只作為飼料中調(diào)節(jié)腸胃劑使用，所以對其數(shù)量要求不大。經(jīng)過正交試驗(yàn)，布拉酵母菌和凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量見表2所示，并用DPS軟件進(jìn)行極差分析，根據(jù)分析結(jié)果選出最佳配方。

由R值可知，影響正交試驗(yàn)結(jié)果的因素依次為A＞D＞B＞C，即影響發(fā)酵后布拉酵母菌產(chǎn)量的因素依次為葡萄糖、磷酸二氫鉀、蛋白胨、硫酸鎂。

從K值也可以看出，在A3B1C2D3配方下，混合固體發(fā)酵培養(yǎng)基生長的布拉酵母菌數(shù)量最多，即以固體培養(yǎng)基（包括麩皮、豆餅粉、玉米粉）為底料，加入4%葡萄糖、無蛋白胨、0.005%硫酸鎂、0.1%磷酸二氫鉀，5%接種量，30℃培養(yǎng)48 h，布拉酵母菌與凝結(jié)芽孢桿菌混合固體發(fā)酵培養(yǎng)基能得到較高產(chǎn)量的布拉酵母菌。

2.2 正交試驗(yàn)相關(guān)性分析

根據(jù)2.1正交試驗(yàn)結(jié)果，對各因素做相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。

表3 相關(guān)性分析

由表3所示，對于布拉酵母菌來說，葡萄糖、磷酸二氫鉀和硫酸鎂為正相關(guān)，蛋白胨為負(fù)相關(guān)。對于凝結(jié)芽孢桿菌來說，四個(gè)因素均為負(fù)相關(guān)。

結(jié)合兩組相關(guān)性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)中蛋白胨均為負(fù)相關(guān)。在發(fā)酵底物中含有豐富的氮源，豆餅粉、玉米粉都可以作為菌種的氮源，所以在發(fā)酵底物中不需要再過多添加氮源。說明在培養(yǎng)基添加劑優(yōu)化中可以嘗試少添加蛋白胨或者不再添加其它氮源，從而提高布拉酵母菌及凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量。

在表3中，葡萄糖、硫酸鎂和磷酸二氫鉀的添加對凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量均為負(fù)相關(guān)，對布拉酵母菌數(shù)量為正相關(guān)。說明這三個(gè)因素的添加只利于布拉酵母菌的生長，不利于凝結(jié)芽孢桿菌的生長，所以在實(shí)際生產(chǎn)中，可根據(jù)兩菌種的需求量，平衡調(diào)整三個(gè)因素的添加量。由于本試驗(yàn)要求以布拉酵母菌數(shù)量為主要指標(biāo)，所以在不過多影響凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量的前提下可以稍微提高三個(gè)因素添加量。

2.3 重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果與分析

重復(fù)試驗(yàn)如下做兩組：取10 g固體發(fā)酵培養(yǎng)基，1∶1加水，混合均勻，加入4%葡萄糖，不加蛋白胨，0.005%硫酸鎂，0.1%磷酸二氫鉀，滅菌。然后接入1 ml布拉酵母菌和1 ml凝結(jié)芽孢桿菌，30℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后按照先前的方法測量布拉酵母菌和凝結(jié)芽孢桿菌的含量。測量結(jié)果見表4。

表4 最佳配方重復(fù)試驗(yàn)

由表4可知，此次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果布拉酵母菌含菌量高于正交試驗(yàn)中數(shù)值，表示最佳配方確實(shí)提高了布拉酵母菌數(shù)量。而凝結(jié)芽孢桿菌沒有高于正交試驗(yàn)中最大值，但也處于相對較多的水平上。結(jié)合2.2中相關(guān)性分析，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果剛好驗(yàn)證相關(guān)性分析結(jié)論。由于飼料中主要數(shù)據(jù)指標(biāo)為布拉酵母菌數(shù)量，所以優(yōu)化后配方在保證布拉酵母菌數(shù)量最大化的前提下，盡量加大了凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量，達(dá)到二者兼顧的目的，初步判斷此配方成立。

3 討論與結(jié)論

①在接種的時(shí)候一定要均勻的將菌種接入到固體培養(yǎng)基中。在固體培養(yǎng)基中菌體活動(dòng)能力沒有在液體培養(yǎng)基中強(qiáng)，接種不均勻可能導(dǎo)致菌體生長不統(tǒng)一，獲得營養(yǎng)成分不一致等問題，會給試驗(yàn)結(jié)果帶來影響。而且，固體發(fā)酵底料要妥善保存，避免染菌變質(zhì)導(dǎo)致營養(yǎng)被消耗。

②通過對布拉酵母菌與凝結(jié)芽孢桿菌混合固體發(fā)酵正交試驗(yàn)分析及相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4%葡萄糖、不加蛋白胨、0.005%硫酸鎂、0.1%磷酸二氫鉀，各接入5%的布拉酵母菌和凝結(jié)芽孢桿菌，30℃培養(yǎng)48 h，布拉酵母菌與凝結(jié)芽孢桿菌混合固體發(fā)酵培養(yǎng)基能得到較高產(chǎn)量的布拉酵母菌。