金龍蛇顆粒對(duì)缺氧環(huán)境下胃癌BGC-823細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

徐晶鈺，張璇，裴蓓，秦志豐，陸燁，魏品康*

(解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200003)

摘要：目的探討金龍蛇顆粒對(duì)缺氧狀態(tài)下胃癌BGC-823細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響并初步研究該過(guò)程的相關(guān)機(jī)理。方法將胃癌BGC-823細(xì)胞分成3組：常氧對(duì)照組、缺氧對(duì)照組(加入150 μmol/L的CoCl2)、金龍蛇顆粒含藥血清組。觀察3組細(xì)胞形態(tài)變化；RT-PCR檢測(cè)3組細(xì)胞E-cad、N-cad、Vimentin mRNA表達(dá)變化。結(jié)果常氧對(duì)照組的胃癌BGC-823細(xì)胞排列較致密，為上皮樣表現(xiàn)；缺氧對(duì)照組大部分細(xì)胞排列較前松散，形態(tài)較前拉長(zhǎng)，呈間質(zhì)樣表現(xiàn)；金龍蛇顆粒含藥血清組介于二者之間。金龍蛇顆粒含藥血清組與缺氧對(duì)照組相比，E-cad mRNA表達(dá)升高，N-cad、Vimentin mRNA表達(dá)降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論金龍蛇顆?？梢种迫毖醐h(huán)境中胃癌BGC-823細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，可能與其下調(diào)N-cad、Vimentin mRNA表達(dá)，升高E-cad mRNA表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：金龍蛇顆粒;E-cad;N-cad;Vimentin;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;缺氧;大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.023

中圖分類號(hào)：R273文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)08-0830-03

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(81302933，81202678)；上海市中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展3年行動(dòng)計(jì)劃(ZYSNXD-CC-ZDYJ024)；第二軍醫(yī)大學(xué)青年啟動(dòng)基金(2012QN17)資助。

作者簡(jiǎn)介:徐晶鈺(1983-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤防治。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2014-12-21)

*通信作者:魏品康，電話-(021)81885474，電子信箱-zhangxuan0918@163.com

Jinlongshe Granules on epithelial-mesenchymal transition in gastric

cancer cells BGC-823 under hypoxia microenvironment

XU Jingyu,ZHANG Xuan,PEI Bei,QIN Zhifeng,LU Ye,WEI Pinkang*

(Department of Traditional Chinese Medicine,Changzheng Hospital Affiliated to Second Military

Medical University,Shanghai 200003,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Jinlongshe granules on EMT of gastric cancer cell BGC-823 under the microenvironment of hypoxia,and to explore the mechanism of the process.MethodsThe cells were divided into three groups:normal control group(cultured under normal condition);hypoxia control group(cultured with CoCl2);Jinlongshe granules group(co-cultured with CoCl2 and Chinese herbal medicine serum).Microscopy was used to observe the different morphological change among the three groups and E-cad,N-cad,Vimentin mRNA were detected by RT-PCR.ResultsThe cells of normal control group became close together like epithelial features;the cells of hypoxia control group became loose like mesenchymal features;the result of Jinlongshe granules group was between the other two groups.RT-PCR showed that the E-cad mRNA of Jinlongshe granules group was raised significant and the N-cad,Vimentin mRNA of Jinlongshe granules group was reduced significant compared with hypoxia control group (P<0.01).ConclusionJinlongshe granules can inhibit the EMT of gastric cancer cell BGC-823 under the microenvironment of hypoxia.The mechanism maybe related to the reduction of N-cad,Vimentin mRNA and raise of E-cad mRNA.

Keywords:Jinlongshe granules;E-cad;N-cad;Vimentin;epithelial-mesenchymal transition;hypoxia;rat

胃癌是國(guó)內(nèi)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高居第二位[1]。由于發(fā)病時(shí)多處于中晚期，其主要治療方式為手術(shù)和化療，療效始終不能令人滿意[2]。原發(fā)灶的侵襲轉(zhuǎn)移是致死和導(dǎo)致生活質(zhì)量下降的重要原因[3]。中醫(yī)藥在胃癌輔助治療上具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可以對(duì)患者整體調(diào)節(jié)，改善體內(nèi)環(huán)境，毒副作用小，因此研究有效的復(fù)方制劑勢(shì)在必行[4]。金龍蛇制劑是我科治療胃癌的經(jīng)驗(yàn)方，以消痰散結(jié)為治則，由魏品康教授經(jīng)40余年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，療效確切[5]。本研究將從缺氧環(huán)境中胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化角度，進(jìn)一步對(duì)金龍蛇顆粒逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1實(shí)驗(yàn)材料

制南星、制半夏、山慈菇等中藥材均購(gòu)自上海雷允上中藥飲片藥材有限公司，符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬上海長(zhǎng)征醫(yī)院制劑室制成含生藥材53.3 g/mL的浸膏；CoCl2來(lái)自Sigma公司；E-cad抗體、N-cad抗體、Vimentin抗體均來(lái)自Abcam公司。二氧化碳培養(yǎng)箱來(lái)自SANYO；倒置顯微鏡來(lái)自重慶光電有限公司；酶標(biāo)儀來(lái)自普朗DNM-9602。清潔級(jí)雄性SD大鼠,280～320 g，由中科院上海試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(滬)：2012-0002；胃癌BGC-823細(xì)胞，由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1金龍蛇顆粒含藥血清的制備大鼠隨機(jī)分為金龍蛇顆粒組和空白對(duì)照組,各5只。金龍蛇顆粒組予中藥浸膏21.36 g/kg灌胃，每天早8點(diǎn)，午1點(diǎn)；空白對(duì)照組每次給予生理鹽水2 mL。連續(xù)給藥5 d，末次給藥后1 h，麻醉大鼠，摘眼球取血，采血前禁食不禁水12 h,室溫下靜置1 h，5 000 r/min，10 min離心，56 ℃水浴滅活30 min，過(guò)濾分裝采用0.22 μm濾膜，存放于-20 ℃。

2.2細(xì)胞分組胃癌細(xì)胞復(fù)蘇，密度調(diào)至1×106個(gè)/mL后均勻接種于96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。常氧對(duì)照組:繼續(xù)培養(yǎng)24 h；缺氧模型組:用150 μmol/L CoCl2加入培養(yǎng)基中，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h；金龍蛇顆粒含藥血清組：先加入含藥血清，再用150 μmol/L CoCl2處理胃癌細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.3觀察胃癌BGC-823細(xì)胞形態(tài)變化按上述分組，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞E-Cad、N-cad、Vimentin mRNA表達(dá)，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。根據(jù)說(shuō)明書提取RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各目標(biāo)基因mRNA。內(nèi)參選用GAPDH，由上海Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成引物。引物序列見表1。

表1　各基因PCR引物序列

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1倒置顯微鏡觀察胃癌BGC-823細(xì)胞形態(tài)變化常氧對(duì)照組細(xì)胞排列較致密，大部分為上皮細(xì)胞表現(xiàn)，缺氧對(duì)照組大部分細(xì)胞排列較前松散，形態(tài)有所改變，較前拉長(zhǎng)，呈間質(zhì)樣表現(xiàn)。金龍蛇顆粒含藥血清組介于二者之間。

3.2RT-PCR檢測(cè)金龍蛇顆粒對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞E-Cad、N-cad、Vimentin mRNA表達(dá)的影響見表2。

組 別E-CadN-cadVimentin常氧對(duì)照組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 缺氧對(duì)照組 0.32±0.03#1.65±0.07#1.80±0.08#金龍蛇顆粒血清組0.63±0.05△1.33±0.07△1.39±0.07△

注：與常氧對(duì)照組比較，#P<0.01；與缺氧對(duì)照組比較，△P<0.01

缺氧對(duì)照組與常氧對(duì)照組E-cad mRNA表達(dá)比較明顯降低，N-cad、Vimentin mRNA表達(dá)比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；金龍蛇顆粒含藥血清組與缺氧對(duì)照組相比，E-cad mRNA表達(dá)升高，N-cad、Vimentin mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4討論

由于腫瘤惡性增殖，新生血管生成相對(duì)不足，使整個(gè)腫瘤處于缺氧環(huán)境中[6]。缺氧容易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化又是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要前提[8]。因此從上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化入手，探討抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移具有十分明確的現(xiàn)實(shí)意義。

細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化需要特征[9]:1)細(xì)胞形態(tài)的改變。由緊密排列的立方上皮樣細(xì)胞向松散的紡錘間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變；2)上皮標(biāo)記物向間質(zhì)標(biāo)記物的轉(zhuǎn)變。E-cad表達(dá)的喪失標(biāo)志著細(xì)胞發(fā)生EMT[10];而間質(zhì)特性的標(biāo)記物N-cad、Vimentin表達(dá)的增高意味著細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力提高，則更容易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[11]。

我科前期已經(jīng)就“從痰論治胃癌”做了大量研究。魏品康教授在經(jīng)典痰證理論上進(jìn)行創(chuàng)新，提出腫瘤“痰污染”學(xué)說(shuō)，并認(rèn)為腫瘤缺氧微環(huán)境也屬于“痰污染”[12]，以消痰散結(jié)為治則的金龍蛇顆?？梢郧宄滴廴?，對(duì)胃癌療效確切[13]。實(shí)驗(yàn)上可以干擾胃癌細(xì)胞增殖[14]；促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[15]；抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移[16]；影響胃癌新生血管生成[17]等；臨床上可以延長(zhǎng)患者生存期，提高患者生活質(zhì)量[18]等。

相對(duì)于缺氧對(duì)照組，金龍蛇顆粒不僅能使胃癌細(xì)胞形態(tài)變化發(fā)生部分逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞間的聯(lián)接由松散變得致密；同時(shí)也使上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的上皮樣標(biāo)記物(E-cad)有所提高，間質(zhì)樣標(biāo)記物(N-cad、Vimentin)有所降低，證實(shí)了金龍蛇顆粒能逆轉(zhuǎn)缺氧環(huán)境中胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

在今后的研究中，我們將進(jìn)一步探討金龍蛇顆粒逆轉(zhuǎn)缺氧環(huán)境中胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)理，這將對(duì)從痰論治胃癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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