扶正剔邪搜絡(luò)方改善肺纖維化大鼠肺功能的機(jī)制研究

練毅剛1,張立山1,吳華陽1,閆玉琴2,王晨3,周紹忠1,關(guān)秋紅1,李德瑩1,蘇惠萍1*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，100700；2.北京市隆福醫(yī)院，北京 100700；

3.懷柔區(qū)第一醫(yī)院，北京 100700)

摘要：目的通過扶正剔邪搜絡(luò)方治療肺纖維化大鼠，觀察不同時(shí)相大鼠肺功能與血清指標(biāo)關(guān)系,探究其作用機(jī)制及適宜療程。方法將128只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、中藥組、激素組，每組32只。使用氣管內(nèi)推注博萊霉素以建立肺纖維化模型，正常對照組注射相同體積的生理鹽水。造模后24 h，中藥組使用扶正剔邪搜絡(luò)方,0.74 g/(kg·d)，激素組使用潑尼松，5 mg/(kg·d)，正常對照組和模型組使用相同體積的生理鹽水。在用藥后第7、14、28、45 d時(shí),分別觀察每組肺吸氣阻力(Ri)、順應(yīng)性(Cl)、用力肺活量(FVC)、吸氣阻力(Ri)、呼出氣量為25%～75%肺活量時(shí)平均流量(FEF25%-75%)變化、第0.2秒末呼出容積(Fev0.2)。結(jié)果1)與模型組比較，中藥組14 d時(shí)FVC、FEF25%-75%、Cl顯著性升高(P<0.01)，28，45 d時(shí)Fev0.2、Ri、FEF25%-75%、Cl差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。2)Ⅲ型膠原14、45 d中藥組表達(dá)明顯低于模型組。3)中藥組Smad3、4蛋白表達(dá)明顯低于西藥組,Smad7蛋白表達(dá)明顯高于西藥組。結(jié)論扶正剔邪搜絡(luò)方可改善肺纖維化大鼠肺功能，其作用機(jī)制為調(diào)節(jié)Smad蛋白及降低Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)來延緩肺間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：扶正剔邪搜絡(luò)方；肺纖維化；肺功能；機(jī)制研究；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.04.031

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)04-0410-05

基金項(xiàng)目:北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(7102096)。

作者簡介:練毅剛(1972-)，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥防治肺間質(zhì)纖維化研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2014-09-21)

*通信作者:蘇惠萍,電話:010-84013357，電子信箱:suhuiping@126.com。

Mechanistic investigation of Fuzheng Tixie Souluo therapeutics on lung

function of pulmonary fibrosis rats

LIAN Yigang1,ZHANG Lishan1,WU Huayang1,YAN Yuqin2,WANG Chen3,ZHOU Shaozhong1,GUAN Qiuhong1,

LI Deying1,SU Huiping1*

(1.Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China;

2.Longfu Hospital of Beijing City,Beijing 100700,China;

3.The First Hospital of Huairou District,Beijing 100700,China)

Abstract:ObjectiveThrough Fuzheng Tixie Souluo therapeutics treatment for pulmonary fibrosis rat,observe the lung function of rat relation with serum index at various time phases and explore its mechanism of action and appropriate treatment.MethodsThe 128 SD male rats are divided into normal control group,model group,Chinese medicine group and hormone group at random,each of which has 32 rats.Except physiological saline of same volume is injected into the rats in normal control group,bleomycin is injected into the tracheas of the rats in each of other groups for modeling.After being modeled for 24 hours,Fuzheng Tixie Souluo therapeutics was used in Chinese medicine group,0.74g/(kg·d) administered;hormone group use prednisone,5 mg/(kg·d);meanwhile,the physiological saline of same volume is filled into the stomachs of the rats in other two groups till the previous day of use.On the 7 th day,14 th day,28 th day and 45 th day since administration,Observed in each group respectively the inspiratory resistance (Ri),compliance of lung (Cl),forced vital capacity (FVC),inspiratory resistance (Ri),exhaled air is 25%-75% vital capacity when the average flow rate change (FEF25%-75%),the 0.2 seconds end out of the volume (Fev0.2).Results1)Compared with the model group,on the 14th day,FVC,FEF25%-75%,Cl of Chinese medicine group obvious increase (P<0.01).On the 28 th and 45th days,forced expiration volume at 0.2 nd second (Fev 0.2),average expiration flow speed between expiration 25% VC and expiration 75% VC (FEF25%-75%),Ri and Cl are remarkably improved,the differences have statistical significances (P<0.01,P<0.05).2)Compared with that of the model group,the Co III in the Chinese medicine group is obviously weakened on the 14 th and 45 th days.3)The expressions of Smad 3 and Smad 4 in Chinese medicine group were weakened,while the expression of Smad 7 had enhanced.ConclusionFuzheng Tixie Souluo therapeutics can improve lung function of pulmonary fibrosis rats.The mechanisms may be related to the influenced by the regulation of the excessive expression of Smad,also followed the decline of Co Ⅲ.

Keywords:Fuzheng Tixie Souluo therapeutics;pulmonary fibrosis;lung function;mechanistic investigation;rat

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是多種病因?qū)е碌牟煌伍g質(zhì)疾病的共同結(jié)局，具有致命性、進(jìn)行性、慢性的疾病發(fā)展特點(diǎn)[1]。Dempsey等[2]報(bào)道IPF患者中位生存期約3年。本研究擬動(dòng)態(tài)觀察扶正剔邪搜絡(luò)方治療博萊霉素致大鼠肺間質(zhì)纖維化不同時(shí)相肺功能變化，通過分析不同時(shí)相Smad3、Smad4、Smad7信號蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)(Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原)指標(biāo)的變化[3]，以期找到扶正剔邪搜絡(luò)方治療肺間質(zhì)纖維化改善肺功能的作用機(jī)制。通過觀察大鼠造模后肺功能特點(diǎn)，對我院呼吸科治療肺間質(zhì)纖維化用藥規(guī)律總結(jié),自擬扶正剔邪搜絡(luò)方,觀察其對肺纖維化大鼠不同時(shí)相肺功能的作用，以期為中醫(yī)臨床治療肺間質(zhì)纖維化的方法、時(shí)機(jī)及療程提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)并初步探討作用機(jī)理。

1材料與方法

1.1動(dòng)物128只健康清潔級大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，雄性，動(dòng)物許可證號：SCXK(京)2006-0009，提供方為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2藥物與主要試劑扶正剔邪搜絡(luò)方顆粒劑，藥物組成：麥冬、人參、浙貝母、地龍、水蛭等8味中藥，7.440 g/袋，批號：100829，提供方為北京康仁堂藥業(yè)有限公司；鹽酸博萊霉素，15 mg/瓶，批號：Y91450，提供方為日本化藥株式會(huì)社；醋酸潑尼松龍，規(guī)格為：5 mL，0.125 g/支，批號：100514，浙江仙琚制藥股份有限公司。Smad3、Smad4及Smad7檢測試劑盒，北京尚柏生物有限公司。

1.3模型建立與分組大鼠128只，采用隨機(jī)數(shù)字表法,分為正常對照組、模型組、中藥組、激素組,每組32只。按照參考文獻(xiàn)[4-5]制造大鼠肺纖維化模型，采用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉并固定，提起大鼠舌頭，用18號套管針從口腔水平插入，在到達(dá)咽喉部位時(shí)，壓低針尾，讓針頭抬高15°～30°，在插入氣管后，拔出針芯。使用棉球薄片，將其置于套管針外口，如果見到薄片隨呼吸前后運(yùn)動(dòng)，說明套管針已在氣管。此時(shí)通過氣管插管快速注射博來霉素溶液(濃度0.2%，用量5 mg/kg，即2.5 mL/kg)，正常對照組注射相同體積的生理鹽水；繼續(xù)通過氣管插管快速推注空氣0.3 mL，并將大鼠立即直立旋轉(zhuǎn)，以便藥液均勻分布在雙肺內(nèi)。病理結(jié)果顯示，7 d時(shí)出現(xiàn)明顯肺泡炎，14 d可見肺泡炎較前減輕，肺間質(zhì)纖維化開始形成，28 d時(shí)肺間質(zhì)纖維化已經(jīng)是主要病變，模型成功建立。

1.4給藥在造模24 h之后，中藥組參照人體與動(dòng)物體表面積的折算系數(shù),予以扶正剔邪搜絡(luò)方顆粒劑，劑量為0.74 g/(kg·d)，使用去離子水制成藥物混懸液；激素組給予醋酸潑尼松龍，劑量為5 mg/(kg·d)；模型組和正常對照組采用相同體積的生理鹽水灌胃給藥，1次/d。

1.5儀器動(dòng)物呼吸機(jī)Res3020，動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)AniRes2005(北京貝蘭博科技有限公司)。

1.6指標(biāo)檢測

1.6.1肺功能檢測7，14，28，45 d，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法各組取8只。因呼吸機(jī)與氣切插管后麻醉大鼠配合問題，導(dǎo)致7 d中藥組、激素組為7只，45 d正常對照組、激素組為7只。末次給藥后1 h使用水合氯醛(濃度為10%，劑量按3.5 mL/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉，行氣管切開，并將氣管導(dǎo)管插入，之后與動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)連接，測算出每組大鼠呼出氣量為25%～75%肺活量時(shí)平均流量(FEF25%-75%)、第0.2秒末呼出容積(Fev0.2)、用力肺活量(FVC)、肺順應(yīng)性(Cl)、吸氣阻力(Ri)。

1.6.2病理學(xué)檢測肺功能檢測后，摘取大鼠肺臟,使用多聚甲醛固定液(濃度為4%)固定左肺，常規(guī)脫水處理，使用石蠟包埋，切片厚度為5 μm，行Masson染色及HE染色。

1.6.3Smad3、Smad4及Smad7檢測在液氮中保存分離的右肺上葉，使用RT-PCR檢測,通過Bio Rad quanity one軟件定量分析條帶，內(nèi)參抗體采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，使用Smad信號蛋白含量除以GAPDH，得出信號蛋白Smad的相對含量，盡量避免加樣誤差、RNA定量誤差以及各PCR反應(yīng)體系中各孔間的溫差、擴(kuò)增效率不均一等所造成的誤差。

2結(jié)果

2.1病理結(jié)果正常對照組在不同時(shí)相肺泡間隔均未發(fā)現(xiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤。模型組7 d時(shí),間質(zhì)出現(xiàn)不同程度炎癥，Masson染色可以偶見少量膠原纖維[6]；14 d間質(zhì)炎癥明顯，程度比7 d時(shí)減輕，而膠原纖維沉積增多明顯；28 d時(shí)肺組織炎癥較14 d程度減輕明顯，肺泡的正常結(jié)構(gòu)破壞，纖維化區(qū)增大、增多；第45天時(shí)大部分肺組織正常結(jié)構(gòu)破壞，大量膠原纖維在病變區(qū)域沉積，嚴(yán)重病變處形成分房囊性結(jié)構(gòu)，即“蜂窩肺”改變，Masson染色可以見到大量致密膠原纖維。上述結(jié)果符合大鼠肺間質(zhì)纖維化模型表現(xiàn)[7-8]。

2.2肺功能中藥組與模型組比較，7 d肺順應(yīng)性(Cl)、吸氣阻力(Ri)開始改善，中藥組14 d時(shí)FVC、FEF25%～75%、Cl顯著性升高(P<0.01)，28，45 d時(shí)Fev0.2、Ri、FEF25%～75%、Cl差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。

表1　不同時(shí)相各組大鼠肺功能比較 ± s)

注:與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01

2.3Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原相比正常對照組，模型組14，45 d時(shí)Ⅰ型膠原表達(dá)明顯升高。中藥組、激素組在不同時(shí)相Ⅰ型膠原表達(dá)無明顯改善。見表2。

相比正常對照組，模型組14、28、45 d時(shí)Ⅲ型膠原表達(dá)明顯升高。相比模型組，中藥組14、45 d時(shí)，Ⅲ型膠原表達(dá)明顯低于模型組。見表3。

2.4smad3、smad4、smad7干預(yù)組大鼠各時(shí)相Smad3、Smad4的表達(dá)值明顯低于模型組,Smad7表達(dá)水平均高于模型組，中藥組Smad3、4蛋白表達(dá)明顯低于西藥組，Smad7蛋白表達(dá)明顯高于西藥組。見表4～表6。

表2　各組不同時(shí)相Ⅰ型膠原表達(dá)結(jié)果 　ng/mL

注：同一時(shí)相，與模型組比較，# P<0.05，## P<0.01

注：同一時(shí)相，與模型組比較，# P<0.05，## P<0.01

注：同一時(shí)相，與激素組比較，## P<0.01；與模型組比較，△△ P<0.01

注：同一時(shí)相，與激素組比較，## P<0.01；與模型組比較，△△ P<0.01

注：同一時(shí)相，與激素組比較，##P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01

3討論

“初病在經(jīng)在氣”，肺纖維化發(fā)病初期邪氣入絡(luò)，病變部位主要在氣絡(luò)，此時(shí)病情變化快，傳變迅速[9],對應(yīng)西醫(yī)分期為肺泡炎期，以肺泡炎癥滲出為主[10]；“久病入絡(luò)入血”，而隨著病情遷延，正消邪長，邪氣從淺表之絡(luò)傳入深部至脈絡(luò)，入絡(luò)為血絡(luò)，此時(shí)在肺氣虛損基礎(chǔ)上，虛、痰、瘀共同作用而致絡(luò)脈痹阻[11-12]，對應(yīng)西醫(yī)分期為纖維化期，肺泡間隔纖維結(jié)締組織增生和纖維化形成。因此提出假說：“氣絡(luò)病向血絡(luò)病的進(jìn)展過程是肺泡炎期向纖維化期的進(jìn)展過程”，在治療上使用扶正剔邪搜絡(luò)方，麥冬、人參、五味子同用，養(yǎng)陰益氣潤燥，浙貝母等化痰散結(jié)，并針對絡(luò)病之瘀邪特點(diǎn)，選用蟲類藥地龍、水蛭等直入血分，搜剔絡(luò)脈，使干結(jié)難破之瘀得化，絡(luò)痹得開，結(jié)邪得去。

Smads蛋白家族是形成肺纖維化過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過程的重要環(huán)節(jié)，是公認(rèn)形成肺間質(zhì)纖維化的重要通道蛋白質(zhì)[13]。在肺間質(zhì)纖維化的不同時(shí)相,Smads蛋白表達(dá)水平不一，中藥組大鼠Smad3、4的表達(dá)值明顯低于西藥組(P<0.05),Smad7表達(dá)明顯高于西藥組(P<0.05)。14，45 dⅢ型膠原中藥組表達(dá)明顯低于模型組。而在肺功能表現(xiàn)上，中藥組7 d與模型組無顯著變化，14 d時(shí)Cl、FVC與模型組比較變化顯著,28,45 d Ri、Cl、Fev0.2、FEF25%-75%與模型組比較均有顯著變化，相比激素組有較明顯優(yōu)勢。Smads蛋白與Ⅲ型膠原表達(dá)與肺功能情況吻合，說明扶正剔邪搜絡(luò)方既可通過影響信號傳導(dǎo)通路作用于肺泡炎早期，亦可通過減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積(主要是Ⅲ型膠原)而作用于纖維化期[14-15],而Smads蛋白可能為中藥組方起到治療作用的主要靶點(diǎn)之一，亦從分子水平初步推斷肺纖維化相關(guān)的氣絡(luò)病向血絡(luò)病轉(zhuǎn)化過程的物質(zhì)基礎(chǔ)。

研究中發(fā)現(xiàn)，7 d激素組肺功能FVC、Fev0.2均明顯改善，中藥組無明顯改善，病理發(fā)現(xiàn)中藥組第7、14天肺泡炎程度明顯輕于模型組(P<0.05),且較激素組輕，與肺功能不符，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]施毅,陳正堂.現(xiàn)代呼吸病治療學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2002:427.

[2]RAGHU G,COLLARD H R,EGAN J J,et al.An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement:idiopathic pulmonary fibrosis: evidence-based guidelines for diagnosis and management[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,2011,183(6):788-824.

[3]曹慧芬,王慶文.轉(zhuǎn)化生長因子-β及其Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究進(jìn)展[J].中國藥物與臨床,2010,10(1):1145-1147.

[4]張偉,魯香鳳,張曉梅,等.氣管插管快速灌注博萊霉素復(fù)制大鼠肺間質(zhì)纖維化模型[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2008,6(1):60-67.

[5]呂曉東,龐立健.氣管內(nèi)注入博萊霉素致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型方法優(yōu)化分析[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2007,21(2):3-4.

[6]金曉光,代華平,龐寶森,等.博來霉素致大鼠肺纖維化模型肺組織的動(dòng)態(tài)病理變化及其發(fā)生機(jī)制[J].中國病理生理雜志,2009,25(4):708-714.

[7]段斐,孔璐,牛建昭,等.鱉甲軟肝方治療大鼠IPF的病理學(xué)觀察[J].中華實(shí)用中西醫(yī)雜志,2004,4(17):2833.

[8]T H T,BARTON R W,DAMATO D,et al.Differential cellular analysis of bronchoalv eolar lavage fluid obtained at various stages during the development of bleom yeininduced pulmonary fibrosis in the rat[J].The American Review of Respiratory Disease,1982,126(3):488-492.

[9]蔣寧,武維屏.中醫(yī)絡(luò)病學(xué)說與肺間質(zhì)纖維化病機(jī)關(guān)系初探[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2003,9(5):21-22,26.

[10]崔紅生,邱冬梅,武維屏.肺間質(zhì)纖維化從絡(luò)病辨治探析[J].中醫(yī)雜志,2003,44(12):946-947.

[11]武維屏,任傳云.肺間質(zhì)纖維化中醫(yī)辨治思路[J].中醫(yī)雜志,2005,46(2):139-141.

[12]武維屏,趙蘭才.肺間質(zhì)纖維化中醫(yī)證治探析[J].中醫(yī)雜志,2002,43(5):325-326.

[13]唐志宇,李天朗,唐小賓,等.鱉甲煎丸對肺纖維化大鼠TGF-β1及smad信號通路的影響[J].世界中醫(yī)藥,2011,6(6):522-523.

[14]陰智敏,李宏,張玉英,等.水蛭宣痹化纖湯對博萊霉素大鼠特發(fā)性肺纖維化Ⅰ-Ⅲ型膠原表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,14(1):32-34.

[15]鄭向鵬,滑炎卿,張國楨,等.Ⅲ型膠原纖維在實(shí)驗(yàn)性特發(fā)性肺纖維化早期的動(dòng)態(tài)研究[J].上海醫(yī)學(xué),2002,25(4):205-209.