■張璐璐 衛(wèi)旭彪 馬 廣 張日俊

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

隨著人們生活水平的提高，玉米纖維和豆渣的產(chǎn)量逐年升高。固態(tài)發(fā)酵玉米纖維、豆渣作為動(dòng)物飼料成為高效利用糧食加工副產(chǎn)物的一種重要生產(chǎn)方式。工業(yè)生產(chǎn)中菌種的選擇不但能夠影響發(fā)酵后飼料的感官并且決定發(fā)酵后飼料的品質(zhì)。以酵母菌作為發(fā)酵菌種，不僅能夠提高發(fā)酵飼料的風(fēng)味，還能夠降解纖維素和生產(chǎn)菌體蛋白，提高飼料的利用價(jià)值[1]。酵母菌在飼料工業(yè)中有廣泛的用途，易于在含糖量較高的偏酸性環(huán)境中生長。張亮等（2007）從實(shí)驗(yàn)室海洋酵母種庫中篩選到一株CMC酶酶活為4.51 U/mg，濾紙酶酶活為4.75 U/mg的普魯蘭類酵母[2]。Sarawan等（2013）篩選到一株能產(chǎn)纖維素酶的假絲酵母菌KKUFW 10，在含有1.0%羧甲基纖維素的YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h所產(chǎn)纖維素酶酶活為58.24 U/ml[3]。酵母的代謝產(chǎn)物中含有豐富的維生素、氨基酸和促生長因子，然而關(guān)于產(chǎn)纖維素酶的酵母菌卻鮮于報(bào)道。因此，本研究從高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選入手，對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，生物學(xué)特性研究，為玉米纖維和豆渣的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要基礎(chǔ)，對(duì)解決玉米纖維和豆渣的利用問題提供了必要前提，并具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

米酒、酒糟、實(shí)驗(yàn)室保存菌種由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑配制

YPD培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、CMC-Na培養(yǎng)基、BPY培養(yǎng)基、酵母菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米粉20 g、酵母浸提物10 g、大豆蛋白胨20 g、麩皮5 g、1 000 ml蒸餾水、pH值6.0）、培養(yǎng)基Ⅰ[酵母浸提物10 g、大豆蛋白胨20 g、葡萄糖（單獨(dú)滅菌）10 g、CMC-Na 5 g、pH值6.8、蒸餾水1 000 ml]、培養(yǎng)基Ⅱ（酵母浸提物10 g、大豆蛋白胨20 g、葡萄糖5 g、CMC-Na 10 g、蒸餾水1 000 ml、pH值6.0）、DNS試劑、pH值4.8乙酸緩沖液、10 mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液、10 mg/ml的木糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.3 產(chǎn)纖維素酶酵母菌的分離篩選

1.3.1 酵母菌的分離

取2 g或2 ml新鮮樣品，加入盛有18 ml無菌生理鹽水的三角瓶中，加滅菌玻璃珠，振蕩2～3 min混勻，靜置2 h，吸取5 ml上清液，加入無菌試管中。然后用無菌生理鹽水按10倍稀釋度逐級(jí)稀釋至10-4、10-5、10-6梯度，在孟加拉紅培養(yǎng)基上涂布，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，28℃、培養(yǎng)48 h，挑取具有酵母菌菌落特征且菌落較大的單菌反復(fù)在YPD培養(yǎng)基上劃線分離至長出單菌落，并鏡檢確定菌體為純菌后，進(jìn)行YPD斜面保存。

1.3.2 產(chǎn)纖維素酶酵母菌的篩選

1.3.2.1 初篩

將分離到的酵母菌分別接種到裝有30 ml YPD液體培養(yǎng)基的100 ml三角瓶中，在28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，按10倍逐級(jí)稀釋并涂布于CMC-Na培養(yǎng)基上，放置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。采用0.2%的剛果紅染色30 min，洗去染液，最后用5%醋酸溶液固定顏色。觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈，測(cè)量透明圈和菌落直徑并計(jì)算其比值，挑選比值較大的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.2.2 復(fù)篩

將初篩到的產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的菌株以1%的接種量接種于酵母菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵12 h后補(bǔ)加CMC-Na使培養(yǎng)基中CMC-Na的含量為0.5%左右。發(fā)酵后在 5 000 r/min的離心機(jī)上離心10 min，收集上清液即為待測(cè)粗酶液。測(cè)定纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活，選取酶活最大的為目標(biāo)菌株。

1.4 酶活測(cè)定方法

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用10 mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制濃度分別為0、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/ml一系列梯度的葡萄糖溶液，每一濃度3個(gè)平行，利用分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)其吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。

圖1 葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.2 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用10 mg/ml的木糖標(biāo)準(zhǔn)液配制濃度分別為0、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/ml一系列梯度的木糖溶液，每一濃度3個(gè)平行，利用分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)其吸光度，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2）。

圖2 木糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.3 粗酶液的制備

液體樣品采取液態(tài)發(fā)酵后，離心，取上清液，即為粗酶液；固態(tài)樣品采取固態(tài)發(fā)酵后取1.0 g發(fā)酵料加10 ml蒸餾水，室溫下振蕩浸泡1 h，離心，取上清液，即為粗酶液。

1.4.4 纖維素內(nèi)切葡聚糖酶活力測(cè)定

取3支25 ml刻度的比色管，分別加入1.5 ml 1%的CMC-Na（pH值4.8乙酸緩沖液配制）。其中2支作為待測(cè)試管，在（50±0.5）℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min，再加入0.5 ml粗酶液，另1支作為空白對(duì)照試管，同時(shí)置于（50±0.5）℃ 恒溫水浴鍋中水浴20 min，然后取出3支試管，并把空白對(duì)照試管迅速放入冰水中，向待測(cè)試管中加入3 ml DNS。待空白對(duì)照試管冷卻后加入0.5 ml粗酶液和3 ml DNS。將三支試管沸水浴5 min后，迅速放入冰水中冷卻，加蒸餾水至25 ml，以空白對(duì)照試管調(diào)零，在540 nm波長下測(cè)量OD值。

1.4.5 纖維素外切葡聚糖酶活力測(cè)定

取3支25 ml刻度的比色管，分別加入50 mg的脫脂棉球和1.5 ml乙酸沖液。其中2支作為待測(cè)試管，在（50±0.5）℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min，再加入0.5 ml粗酶液，另取1支作為空白對(duì)照試管，同時(shí)置于（50±0.5）℃恒溫水浴鍋中水浴20 min，然后取出3支試管，并把空白對(duì)照試管迅速放入冰水中，向待測(cè)試管中加入3 ml DNS。待空白對(duì)照試管冷卻后加入0.5 ml粗酶液和3 ml DNS。將3支試管沸水浴5 min后，迅速放入冰水中冷卻，加蒸餾水至25 ml，以空白對(duì)照試管調(diào)零，在540 nm波長下測(cè)量OD值。

1.4.6 木聚糖酶活力測(cè)定

取3支25 ml刻度的比色管，分別加入1.5 ml 1%的木聚糖溶液（pH值4.8乙酸緩沖液配制），其中2支作為待測(cè)試管，在（50±0.5）℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min，再加入0.5 ml粗酶液，另取1支作為空白對(duì)照試管，同時(shí)置于（50±0.5）℃恒溫水浴鍋中水浴20 min，然后取出3支試管，并把空白對(duì)照試管迅速放入冰水中，向待測(cè)試管中加入3 ml DNS。待空白對(duì)照試管冷卻后加入0.5 ml粗酶液和3 ml DNS。將三支試管沸水浴5 min后，迅速放入冰水中冷卻，加蒸餾水至25 ml以空白對(duì)照試管調(diào)零，在540 nm波長下測(cè)量OD值。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察該菌在YPD平板上的菌落形態(tài)和顯微鏡下的菌體形態(tài)。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定

使用酵母菌基因組提取試劑盒提取總DNA，利用5.8SrDNA-ITS進(jìn)行菌種鑒定，并根據(jù)ITS1、ITS4的保守序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，正向引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,反向引物 ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。對(duì)所提酵母菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)DNA提取情況及擴(kuò)增后的分子量。將擴(kuò)增后的基因測(cè)序，并對(duì)所測(cè)的序列在 GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)以確定菌屬。

1.6 酵母菌的馴化

將篩選到的產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的目標(biāo)菌株以1%的接種量接種于培養(yǎng)基Ⅰ中，28℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)6 d。然后，將初步馴化的菌種再接種到培養(yǎng)基Ⅱ中搖床28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，得到馴化后的菌種并進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.7 耐酸性測(cè)定

取純?nèi)樗峒拥結(jié)PD液體培養(yǎng)基中，使pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，每個(gè)pH值分別取250 ml至500 ml三角瓶中，121℃滅菌20 min。冷卻至室溫后接入7.5×108CFU/ml酵母菌28℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于12、24、36、48、60、72 h取樣采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 模擬胃液試驗(yàn)

取1 mol/l的鹽酸加水稀釋至pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5，每個(gè)pH值分別取30 ml至100 ml三角瓶中121℃滅菌20 min，冷卻至室溫，用濾菌器向每個(gè)三角瓶中加入0.5 g胃蛋白酶，搖勻后待用，將培養(yǎng)12 h后的菌液3 ml加入各三角瓶中，分別測(cè)定酵母菌在0、1、2、3、4 h的OD600nm，并計(jì)算相對(duì)含量。

1.9 模擬腸液試驗(yàn)

將A液（A胰腺液：稱取 1.1 g碳酸氫鈉、0.85 g氯化鈉加入100 ml蒸餾水中，用氫氧化鈉調(diào)pH值至6.8，121℃滅菌20 min，冷卻后，無菌操作下加入1.5 g胰蛋白酶混合備用。）和B液（B膽液：稱取1.2 g牛磺酸膽鹽加入至100 ml蒸餾水中，121℃滅菌20 min。冷卻備用。）以2∶1體積混合即可得到人工腸液，每個(gè)三角瓶取100 ml人工腸液，放置待用。將培養(yǎng)12 h后的菌液3 ml加入各三角瓶中，分別測(cè)定酵母菌在0、1、2、3、4 h的OD600nm，并計(jì)算相對(duì)含量。

1.10 抑菌能力測(cè)定

將金黃色葡萄球菌接種于BPY液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，稀釋活菌數(shù)為106CFU/ml，取100μl涂布于BPY平板。將待測(cè)酵母菌在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后12 000 r/min離心10 min，取200μl上清液加入牛津杯中，37℃培養(yǎng)12 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)纖維素酶酵母菌篩選

對(duì)篩到的12株菌進(jìn)行CMC-Na平板篩選后，獲得5株能夠產(chǎn)纖維素酶的菌株（見圖3），并測(cè)量和計(jì)算菌落直徑、透明圈直徑、透明圈直徑與菌落直徑的比值（見表1）。選取透明圈直徑與菌落直徑較大的菌株進(jìn)行纖維素內(nèi)切葡聚糖酶活力測(cè)定（見表2）。由表2可知，Y3內(nèi)切葡聚糖酶活最高為2.92 U/ml，選定此菌株為目標(biāo)菌株。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

所篩酵母菌在YPD平板上菌落呈乳白色，濕潤、圓形、表面光滑、邊緣整齊、頂部突起、不透明（見圖4a）。鏡檢觀察菌株細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞較大，呈圓形或橢圓型，出芽生殖（見圖4b）。

圖3 釀酒酵母菌Y3在CMC-Na平板上的水解圈

表1 酵母菌的初篩結(jié)果

表2 酵母菌的復(fù)篩結(jié)果（U/ml）

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

將所選目標(biāo)菌株使用ITS1和ITS4引物對(duì)其5.8S rDNA-ITS區(qū)基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物900 bp。在GenBank對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所篩的Y3菌株序列片段與GenBank中釀酒酵母菌序列片段相似性達(dá)99%，從而鑒定其為釀酒酵母菌。

2.3 馴化后釀酒酵母菌Y3酶活

馴化后的酵母菌能有更高的耐受和產(chǎn)酶能力[4-5]。釀酒酵母菌Y3進(jìn)行馴化，馴化后此菌株纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活達(dá)到3.27 U/ml，纖維素外切葡聚糖酶酶活為2.22 U/ml，木聚糖酶酶活為4.21 U/ml。

2.4 耐酸性試驗(yàn)

飼料發(fā)酵過程中，通常pH值＜3.8時(shí)，有害菌才能完全被抑制，乳酸菌是主要產(chǎn)酸的菌。酵母菌一般在pH值4.0～6.0的環(huán)境中生長[6]。因此，耐酸的酵母菌的篩選將有利于飼料的發(fā)酵和提高飼料的發(fā)酵品質(zhì)。本試驗(yàn)測(cè)定了篩選到的釀酒酵母菌Y3在不同pH值下，作用不同時(shí)間，酵母菌的活菌數(shù)，結(jié)果見表3。由表3可知，該酵母菌株對(duì)乳酸有較高的耐受性，并且該酵母菌隨著時(shí)間不斷增殖。在pH值2.5環(huán)境中，該酵母菌在36 h達(dá)到最大的生物量1.90×108CFU/ml。在pH值3.0～4.0環(huán)境中，該酵母菌在48 h達(dá)到最大生物量，分別是2.40×108、3.15×108、3.05×108CFU/ml。

圖4 菌株Y3的形態(tài)學(xué)鑒定

表3 釀酒酵母菌Y3耐酸性試驗(yàn)結(jié)果（×108 CFU/ml）

2.5 模擬胃液試驗(yàn)

成年豬胃與家禽肌胃內(nèi)正常pH值為2.0～3.5，能夠殺死大部分的微生物。微生物只有耐受胃液，才能進(jìn)入小腸定植[7]。本試驗(yàn)測(cè)定了釀酒酵母菌Y3在不同pH值的模擬胃液中作用不同時(shí)間酵母菌的相對(duì)活菌數(shù)，結(jié)果見表4。由表4可知，該酵母菌對(duì)模擬胃液有較強(qiáng)的耐受性。在pH值1.5的模擬胃液中，該菌株的相對(duì)活菌數(shù)隨時(shí)間逐漸降低，4 h時(shí)相對(duì)活菌數(shù)為68.0% 。當(dāng)pH值≥2.0時(shí)，該菌株在前1 h進(jìn)入適應(yīng)期，之后菌株的相對(duì)活菌數(shù)隨時(shí)間逐漸增加，并且pH值越大越適宜該菌株的繁殖。

表4 釀酒酵母菌Y3耐模擬胃液試驗(yàn)結(jié)果（%）

2.6 模擬腸液試驗(yàn)

動(dòng)物腸道中存在大量的微生物，也是益生菌發(fā)揮作用的主要場(chǎng)所[8]。然而，小腸液偏堿性且含有大量的酶與膽鹽，膽鹽能夠阻止微生物在腸道中增殖[9-10]，因此，腸道環(huán)境不利于微生物的增殖。本試驗(yàn)測(cè)定了篩選到的釀酒酵母菌Y3在模擬腸液中作用不同時(shí)間酵母菌的相對(duì)活菌數(shù)，結(jié)果見圖5。由圖5可知，該株釀酒酵母菌對(duì)模擬腸液的耐受性較弱，模擬腸液處理3 h，該株酵母菌相對(duì)活菌數(shù)是37.0%；模擬腸液處理處理1 h，該株釀酒酵母菌相對(duì)活菌數(shù)是77.8%。

圖5 釀酒酵母菌Y3耐模擬腸液試驗(yàn)結(jié)果

2.7 抑菌能力試驗(yàn)

通過取釀酒酵母菌Y3培養(yǎng)物的上清液，進(jìn)行牛津杯37℃培養(yǎng)12 h后，發(fā)現(xiàn)未出現(xiàn)透明圈（見圖6），即該酵母菌未能產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌的物質(zhì)。

3 結(jié)論

通過初篩和復(fù)篩得到一株能夠產(chǎn)纖維素酶的酵母菌Y3，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定后，確定為釀酒酵母菌。酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該菌株所產(chǎn)纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活為3.27 U/ml，纖維素外切葡聚糖酶酶活為2.22 U/ml，木聚糖酶酶活為4.21 U/ml。此菌株有較強(qiáng)的耐酸和耐豬膽鹽特性，在pH值2.5的乳酸環(huán)境中36 h，該酵母菌的生物量為1.90×108CFU/ml，在pH值1.5的模擬胃液中4 h，該酵母菌相對(duì)活菌數(shù)是68.0%。但該菌對(duì)模擬腸液耐受性較差，在模擬腸液處理3 h，其相對(duì)活菌數(shù)為37.0%；該菌對(duì)金黃色葡萄球菌沒有抑制作用。

圖6 釀酒酵母菌Y3抑菌試驗(yàn)圖