■張璐璐 衛(wèi)旭彪 斯大勇 鄭召君 馬 廣 張日俊

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

我國(guó)是世界上生產(chǎn)和消費(fèi)玉米、大豆的大國(guó)，2013年中國(guó)玉米產(chǎn)量達(dá)到21 500萬(wàn)噸以上，大豆消費(fèi)量約為7 118萬(wàn)噸。玉米纖維和豆渣是玉米和大豆在加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。玉米纖維和豆渣由于理化性質(zhì)的特殊性，因而它們作為動(dòng)物飼料有很多的限制。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)玉米纖維和豆渣如何高質(zhì)化利用進(jìn)行了大量研究，常用的方法主要有物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法。但是，現(xiàn)在產(chǎn)業(yè)中處理玉米纖維和豆渣采用的強(qiáng)烈溶劑法處理，幾乎會(huì)導(dǎo)致玉米纖維中100%水溶性纖維、50%～60%半纖維素和10%～30%纖維素溶解，從而造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的極大損失[1]。同樣，采用物理方法對(duì)糧食加工副產(chǎn)物處理也造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的極大損失。每年我國(guó)面對(duì)龐大的糧食加工副產(chǎn)物的現(xiàn)實(shí)，采用微生物處理是最好的選擇。芽孢桿菌在食品和工業(yè)領(lǐng)域已經(jīng)安全運(yùn)用多年，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，易于分離、培養(yǎng)，抗逆性強(qiáng)。動(dòng)物飼料中運(yùn)用產(chǎn)酶的菌株較多的是芽孢桿菌。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的芽孢桿菌。梁艷玲(2014)[2]從生境中篩選出一株地類芽孢桿菌ME27-1，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 h后，其CMC酶酶活為0.17 U/ml。陳珊等(2014)[3]從長(zhǎng)白山森林土壤中篩到一株地衣芽孢桿菌，在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后，其CMC酶酶活為1.82 U/ml。Abdullah等（2014）[4]利用物理和化學(xué)誘變得到一株CMC酶最大酶活為1 250 U/ml的芽孢桿菌N3。Gaur等（2015）[5]從土壤中分離到一株纖維素酶最大酶活為4 105 U/ml的芽孢桿菌RG-07。本試驗(yàn)根據(jù)芽孢桿菌能產(chǎn)芽孢、抗逆性強(qiáng)和產(chǎn)酶量大的特性，從土壤、牛瘤胃液、馬糞便、牛糞便和實(shí)驗(yàn)室保藏菌種等生境中篩選出一株高產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌，并進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤、腐木、腐葉、牛瘤胃液、馬糞便、雞盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物、青貯飼料、牛糞便、納豆和實(shí)驗(yàn)室保藏菌種由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)試驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑配制

NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基(葡萄糖6 g、酵母膏10 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、KH2PO41 g，蒸餾水500 ml,18%的 Na2CO3500 ml，pH值6.8)、纖維素酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉20 g、玉米纖維20 g、干豆渣30 g、牛肉膏3 g、蛋白胨2 g、NaCl 5 g、MgSO40.5 g、Na2HPO41 g、KH2PO41 g，蒸餾水1 000 ml，pH值6.8，0.5%的CMC-Na)、剛果紅CNC-Na平板、淀粉平板、酪蛋白平板、CMC-Na培養(yǎng)基、pH值4.8乙酸緩沖液、DNS試劑、10 mg/ml的木糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液、10 mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.3 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的分離篩選

1.3.1 芽孢桿菌富集

取2 g或2 ml新鮮樣品，加入盛有18 ml無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩2～3 min混勻，靜置2 h，吸取5 ml上清液，加入無(wú)菌試管中，然后80℃水浴20 min。按10%接種量將水浴后菌液接種到NB培養(yǎng)基中，180 r/min、37℃搖床富集24 h。

1.3.2 芽孢桿菌分離

對(duì)富集后的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，選取10-4、10-5、10-6梯度在NA培養(yǎng)基上涂布，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行，37℃培養(yǎng)24 h得到單菌落，根據(jù)菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢，挑取單菌落進(jìn)行NA斜面保存。

1.3.3 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌初篩

采用平板劃線法，從斜面上挑選菌株在剛果紅CNC-Na平板上劃線，37℃培養(yǎng)48 h，觀察是否出現(xiàn)透明圈。挑選生長(zhǎng)快、透明圈大的單菌落接種到NB培養(yǎng)基中，180 r/min、37℃搖床培養(yǎng)24 h后制成發(fā)酵種子液。用滅菌牙簽蘸取少量菌液點(diǎn)種于CNC-Na平板上，37℃培養(yǎng)2～4 d，采用0.2%的剛果紅染色30 min，用蒸餾水和1 mol/l NaCl依次洗去染液。測(cè)量透明圈和菌落直徑并計(jì)算其比值，挑選比值較大的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.4 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的復(fù)篩

將篩到的產(chǎn)纖維素酶能力強(qiáng)的菌株在種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，以4%的接種量接種到裝有100 ml纖維素酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，180 r/min、37℃搖床培養(yǎng)48 h后，在5 000 r/min的離心機(jī)上離心10 min，收集上清液即為待測(cè)粗酶液。測(cè)定所篩菌株的CMC酶酶活，篩選出產(chǎn)纖維素酶能力強(qiáng)的菌株。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察目標(biāo)菌株在NA平板上形成的菌落形態(tài)，革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察菌體和芽孢形態(tài)。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定

用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取總DNA，利用設(shè)計(jì)引物P1和P2對(duì)gyrA基因片段進(jìn)PCR擴(kuò)增。正向引物 P1：5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′，反向 引 物 P2：5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′。對(duì)所提芽孢桿菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)DNA提取情況。將擴(kuò)增后的基因送測(cè)序公司測(cè)序，并對(duì)所測(cè)的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)以確定菌種。

1.5 產(chǎn)纖維素酶酶活測(cè)定

將篩到的菌群在種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，以4%的接種量接種到裝有100 ml纖維素酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，180 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)48 h后，在5 000 r/min的離心機(jī)上離心10 min，收集上清液即為待測(cè)粗酶液。測(cè)定所篩菌株的纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活、外切葡聚糖酶和木聚糖酶酶活。

1.6 產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶能力測(cè)定

用滅菌的牙簽蘸取少量的菌液分別點(diǎn)種于淀粉平板和酪蛋白平板上，37℃培養(yǎng)48 h，直接觀察酪蛋白平板的菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，在淀粉平板表面滴加碘液觀察是否出現(xiàn)水解圈。

1.7 模擬胃液試驗(yàn)

取1 mol/l的鹽酸加水稀釋至pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5，每個(gè)pH值樣品分別取30 ml至100 ml三角瓶中121℃滅菌20 min，冷卻至室溫，用濾菌器向每個(gè)三角瓶中加入0.5 g胃蛋白酶，搖勻后待用，將培養(yǎng) 12 h后的菌液3 ml加入各三角瓶中，分別測(cè)定解淀粉芽孢桿菌B13在0、1、2、3、4 h的OD600nm，并計(jì)算相對(duì)含量。

1.8 模擬腸液試驗(yàn)

將A液（A胰腺液：稱取 1.1 g碳酸氫鈉，0.85 g氯化鈉加入100 ml蒸餾水中，用氫氧化鈉調(diào)pH值至6.8，121℃滅菌20 min，冷卻后，無(wú)菌操作下加入1.5 g胰蛋白酶混合備用）和B液（B膽液：稱取1.2 g牛磺酸膽鹽加入至100 ml蒸餾水中，121℃滅菌20 min。冷卻備用）以2∶1體積混合即可得到人工腸液，每個(gè)三角瓶取100 ml人工腸液，放置待用。將培養(yǎng)12 h后的菌液3 ml加入各三角瓶中，分別測(cè)定解淀粉芽孢桿菌B13在0、1、2、3、4 h的OD600nm，并計(jì)算相對(duì)含量。

1.9 抑菌能力測(cè)定

圖1 在纖維素平板上的水解圈

將金黃色葡萄球菌接種于BPY液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，稀釋活菌數(shù)為106CFU/ml，取100 μl涂布于BPY平板。將待測(cè)解淀粉芽孢桿菌B13培養(yǎng)24 h后12 000 r/min離心10 min，取200 μl上清液加入牛津杯中，37℃培養(yǎng)12 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌篩選

剛果紅染色是最簡(jiǎn)單且被廣泛用于產(chǎn)纖維素酶菌株篩選。本試驗(yàn)從25個(gè)樣品中分離到28株能夠產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌（見圖1）。對(duì)篩到的28株菌進(jìn)行CMC-Na平板篩選，并測(cè)量計(jì)算菌落直徑、透明圈直徑、透明圈直徑與菌落直徑的比值(見表1)。選取透明圈直徑與菌落直徑比值較大或水解圈較大的菌株進(jìn)行纖維素內(nèi)切葡聚糖酶活力測(cè)定(見表2)。由表2可知，菌株B13內(nèi)切葡聚糖酶酶活最高為7.31 U/ml，選定此菌株為目標(biāo)菌株。

表1 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的初篩

表2 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的復(fù)篩(U/ml)

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

芽孢桿菌在NA平板上呈乳白色、圓形、褶皺、邊緣整齊的菌落(見圖2)。鏡檢菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體為桿狀，兩端鈍圓，單個(gè)或成對(duì)排列，芽孢端生。

圖2 芽孢桿菌B13菌落形態(tài)（左）及革蘭氏染色（右）

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

16S rDNA/RNA基因序列雖然被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定和細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系構(gòu)建，但是其不能用于序列相似度很高的枯草桿菌群的類群間分類[6-7]。gyrA是一段高度保守的基因片段，利用gyrA基因能夠有效地區(qū)分枯草芽孢桿菌組中的近緣種[8]。本試驗(yàn)采用gyrA序列對(duì)所篩到的目標(biāo)菌株B13的基因序列進(jìn)行分析，在GenBank中對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所篩的B13菌株序列片段與GenBank中解淀粉芽孢桿菌的序列片段相似性達(dá)99%，從而鑒定其為解淀粉芽孢桿菌。

2.3 產(chǎn)纖維素酶酶活測(cè)定

解淀粉芽孢桿菌B13經(jīng)液態(tài)發(fā)酵后，其纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活為7.31 U/ml的菌株B13作為目標(biāo)菌株，并測(cè)定其纖維素外切葡聚糖酶酶活為5.26 U/ml，木聚糖酶酶活為32.46 U/ml。

圖3 解淀粉芽孢桿菌B13在淀粉平板上的水解圈(左)及在酪蛋白平板上的水解圈（右）

2.4 產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶檢測(cè)

把芽孢桿菌接種到淀粉平板和酪蛋白平板，發(fā)現(xiàn)所篩目標(biāo)菌株能夠產(chǎn)淀粉酶(見圖3左)和蛋白酶(見圖3右)。

2.5 模擬胃液試驗(yàn)

動(dòng)物胃中較低的pH值能夠殺死大部分微生物[9]，然而芽孢桿菌作為益生菌能夠產(chǎn)生芽孢，有一定的抗逆性。本試驗(yàn)測(cè)定了篩選到的解淀粉芽孢桿菌B13在不同pH值模擬胃液下，作用不同時(shí)間，解淀粉芽孢桿菌B13的相對(duì)存活率，結(jié)果見表3。由表3可知，該芽孢桿菌對(duì)模擬胃液有一定的耐受性；當(dāng)pH值≥2.0時(shí)，處理1 h該芽孢桿菌不但不致死，而且還能生長(zhǎng)，但處理時(shí)間超過1 h后該芽孢桿菌的相對(duì)存活率逐漸下降；pH值1.5對(duì)該菌影響較大，在此pH值下處理4 h其相對(duì)存活率為65.4%。

表3 解淀粉芽孢桿菌B13耐模擬胃液試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.6 模擬腸液試驗(yàn)

動(dòng)物腸道中存在大量的微生物，也是益生菌發(fā)揮作用的主要場(chǎng)所[10]。小腸偏堿性有利于芽孢桿菌的生長(zhǎng)，然而，小腸中存在大量的酶及膽鹽，不利于芽孢桿菌的生長(zhǎng)[11-12]。本試驗(yàn)測(cè)定了解篩選到的解淀粉芽孢桿菌B13在模擬腸液中作用不同時(shí)間芽孢桿菌B13的相對(duì)存活率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，該芽孢桿菌對(duì)模擬腸液的耐受性較弱，該菌的相對(duì)存活率隨著時(shí)間逐漸降低；模擬腸液處理2 h，該株芽孢桿菌相對(duì)存活率為56.6%，處理1 h，該株芽孢桿菌相對(duì)存活率為84.8%。

圖4 解淀粉芽孢桿菌B13模擬腸液試驗(yàn)結(jié)果

2.7 抑菌能力試驗(yàn)

取芽孢桿菌培養(yǎng)物的上清液，進(jìn)行牛津杯37℃培養(yǎng)12 h后，發(fā)現(xiàn)未出現(xiàn)透明圈（見圖5），即該芽孢桿菌未能產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌的物質(zhì)。

圖5 解淀粉芽孢桿菌B13抑菌試驗(yàn)

3 結(jié)論

通過初篩和復(fù)篩，本試驗(yàn)從生境中分離到一株產(chǎn)纖維素酶能力強(qiáng)的芽孢桿菌B13，對(duì)B13菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定后，確定為解淀粉芽孢桿菌。其中纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活為7.31 U/ml，纖維素外切葡聚糖酶酶活為5.26 U/ml，木聚糖酶酶活為32.46 U/ml。此菌株能夠產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶，并且對(duì)模擬胃液有很高的耐受性，對(duì)模擬腸液有一定的耐受性。在模擬胃液試驗(yàn)中，在對(duì)該菌影響最大pH值1.5條件下，處理4 h其相對(duì)存活率為65.4%；該菌在模擬腸液中，處理1 h，該株芽孢桿菌相對(duì)活菌數(shù)是84.8%，處理2 h，該株芽孢桿菌相對(duì)活菌數(shù)為56.6%。該菌對(duì)金黃色葡萄球菌沒有抑制作用。