■ 李?；?張全紅 朱 琪 韓紅杰

（1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300381；2.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心，天津300381；3.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京100096；4.洛陽(yáng)瑞萊生物工程有限公司，河南洛陽(yáng)471000）

先天性免疫是機(jī)體抵抗病原感染的第一道防線。病原微生物感染機(jī)體后，宿主細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別分子（PRRs）識(shí)別病原相關(guān)分子模式（PAMPs），從而誘導(dǎo)先天性免疫。Toll-樣受體（TLRs）是目前研究最為廣泛和深入的一類PRRs，能夠廣泛識(shí)別細(xì)菌、病毒、真菌和原蟲等（Akira等，2006）。不同動(dòng)物中TLRs的種類和數(shù)量都不相同，豬有10種TLRs，主要分布在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞中，也表達(dá)于一些非免疫細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。TLRs識(shí)別病原后，能夠?qū)⒚庖咝盘?hào)通路活化，產(chǎn)生免疫效應(yīng)因子，最終調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，從而清除感染的病原體，促使機(jī)體盡快恢復(fù)到健康狀態(tài)。芽孢桿菌能調(diào)節(jié)豬的免疫功能，

增強(qiáng)抗病能力，發(fā)揮促生長(zhǎng)作用（于新友等，2016），但是在病原菌感染狀態(tài)下，芽孢桿菌對(duì)豬TLRs表達(dá)的影響目前還不清楚。因此，本研究利用大腸桿菌感染仔豬炎癥模型，研究枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬脾臟TLRs表達(dá)的影響，為研究其免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自GeneCopoeia公司。

1.2 引物

試驗(yàn)所用引物序列見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇體重(6.8±0.5)kg“杜×長(zhǎng)×大”商品雜交仔豬8頭，按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為2個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，單欄飼養(yǎng)于專用代謝籠中。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.1%芽孢桿菌制劑，芽孢桿菌為新篩選出的菌株，凍干粉中活菌含量為1×1012CFU/g。

1.4 試驗(yàn)日糧

根據(jù)NRC（2012）配制玉米-豆粕-膨化大豆-魚粉型飼糧，基礎(chǔ)飼糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平如表2所示。

表2 基礎(chǔ)飼糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平

1.5 飼養(yǎng)管理

所有豬只自由采食和飲水，豬舍溫度控制在25～28℃。試驗(yàn)期7 d，攻毒前12 h所有豬只斷水、斷料。試驗(yàn)組仔豬每頭灌服5 ml大腸桿菌K88（每頭豬灌服1×1011CFU），對(duì)照組仔豬每頭灌服5 ml生理鹽水，攻毒后2 h開始供水，但仍然停止供料直至試驗(yàn)結(jié)束。攻毒6 h后仔豬全部屠宰，取脾臟放入液氮中速凍，然后將脾臟轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Toll-樣受體測(cè)定

按照動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取試驗(yàn)組和對(duì)照組脾臟總RNA。采用紫外分光光度法對(duì)RNA進(jìn)行定量后，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA作為模板采用qPCR方法檢測(cè)TLR2和TLR4基因的表達(dá)。qPCR反應(yīng)體系：上游引物（2 μM）、下游引物（2 μM）各2 μl，50'ROX Reference Dey 0.4 μl，cDNA 5 μl，2'All-in-one qPCR Mix 10 μl，加DEPC處理水至20 μl。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 20 s，72 ℃15 s，收集熒光，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線條件：72～95℃，收集熒光。TLR2和TLR4的基因表達(dá)通過(guò)GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并以相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

以每頭豬為單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理；采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件下的Compare Means模塊中的 One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析，并采用T-test組間差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

由表3和圖1可知，在大腸桿菌K88感染下，飼糧添加枯草芽孢桿菌與對(duì)照組相比，能顯著降低仔豬脾臟中TLR2（P＜0.05）和TLR4（P＜0.05）的表達(dá)量，其中TLR2的表達(dá)量下降了46%，TLR4的表達(dá)量下降了50%。

表3 飼糧添加芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬脾臟TLR2和TLR4表達(dá)的影響

圖1 飼糧添加芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬脾臟TLR2和TLR4表達(dá)的影響

3 討論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PRRs有5種，包括Toll-樣受體（TLRs）、視黃酸誘導(dǎo)基因-樣受體（RLR）、NOD-樣受體（NLRs）、C型凝集素受體（CLRs）和AIM2-樣受體（ALRs）（Lan等，2012；DiDonato等，2012），以TLRs的研究最為廣泛和深入。TLRs一旦識(shí)別PAMPs和DAMPs，就能夠激活宿主的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答（Kaisho等，2008）。免疫應(yīng)答的類型和強(qiáng)度都與PRRs識(shí)別PAMPs有關(guān)，根據(jù)識(shí)別PAMPs的性質(zhì)，啟動(dòng)相應(yīng)的免疫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中核因子-κB（NF-κB）信號(hào)途徑是宿主細(xì)胞產(chǎn)生先天性免疫應(yīng)答的主要信號(hào)途徑（Lan等，2012；DiDonato等，2012），當(dāng)TLRs與相應(yīng)的配體結(jié)合后，招募和活化接頭分子向下游傳遞信號(hào)，激活I(lǐng)κB激酶并使IκB磷酸化，磷酸化的IκB進(jìn)而被泛素化，通過(guò)蛋白酶體途徑降解，解除IκB對(duì)NF-κB的限制，NF-κB核定位序列被暴露，從而使NF-κB從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，活化的NF-κB能夠調(diào)控多種細(xì)胞因子的表達(dá)。

細(xì)胞因子具有多種生物功能，在刺激活化免疫細(xì)胞增殖分化、分泌抗體，增強(qiáng)CTL細(xì)胞殺傷活性、刺激單核細(xì)胞等合成、分泌細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的殺滅能力等方面發(fā)揮著重要作用。TLRs不僅大量表達(dá)于脾臟和外周血白細(xì)胞等與免疫相關(guān)的組織及器官中，還大量表達(dá)于肺臟及胃腸道等易受外界環(huán)境侵襲的組織器官中（周敬禹等，2015）。TLR2和TLR4屬于跨膜受體，能夠識(shí)別病原菌的PAMPs，并將信號(hào)進(jìn)行傳遞，最終激活NF-κB而誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)（Kaisho等，2008）。

有研究表明，在生理狀態(tài)下枯草芽孢桿菌對(duì)十二指腸和回腸TLR2的mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響（李云峰等，2011），該研究結(jié)果給我們的提示是，飼喂芽孢桿菌后能夠保持仔豬的健康狀態(tài)。在本試驗(yàn)中，通過(guò)給仔豬灌服致病性大腸桿菌K88建立致病模型，研究在病理狀態(tài)下枯草芽孢桿菌對(duì)TLRs表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能夠顯著降低大腸桿菌感染仔豬脾臟TLR2和TLR4的mRNA表達(dá)水平，說(shuō)明大腸桿菌感染仔豬時(shí)TLR2和TLR4參與調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)。TLR2能夠識(shí)別細(xì)菌表面的脂肽，TLR4識(shí)別革蘭氏陰性菌表面的脂多糖，TLR4是識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌胞壁成分（內(nèi)毒素）的關(guān)鍵分子，大腸桿菌細(xì)胞壁上的脂多糖是其主要的PAMP。研究表明，大腸桿菌能夠激活TLR2和TLR4從而誘導(dǎo)TNF-α、IL-1和IL-8等炎癥因子的表達(dá)（Li等，2012；Chytilova等，2013）。我們的研究結(jié)果顯示，飼喂枯草芽孢桿菌的仔豬在遭受大腸桿菌感染時(shí)，可以通過(guò)降低TLR2和TLR4的表達(dá)達(dá)到減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)的目的。

4 小結(jié)

在致病性大腸桿菌感染模式下，日糧添加枯草芽孢桿菌能降低斷奶仔豬脾臟TLR2和TLR4的表達(dá)水平。

（參考文獻(xiàn)14篇，刊略，需者可函索）