辛明 王加眾 劉卿 譚劉剛 趙孝民

[摘要] 目的 研究地丁豆根白術(shù)湯的抗腫瘤作用。 方法 用地丁豆根白術(shù)湯復(fù)方中藥水提取物作用腫瘤細(xì)胞（sp2/0）和正常細(xì)胞（CEF）24 h，顯微計(jì)數(shù)研究復(fù)方中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用；流式細(xì)胞技術(shù)和AnnexinⅤ-FITC/PI探討復(fù)方中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制；腹腔注射sp2/0細(xì)胞建立小鼠同源腹水型腫瘤模型，灌胃給藥，研究復(fù)方中藥對(duì)發(fā)病小鼠的治療作用。 結(jié)果 2.4 mg/mL的復(fù)方中藥水提取物作用24 h后，可完全殺滅sp2/0細(xì)胞，而對(duì)CEF細(xì)胞無(wú)明顯殺傷作用；2.4 mg/mL的復(fù)方中藥可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式殺傷腫瘤細(xì)胞，藥物作用2 h時(shí)凋亡比率達(dá)到峰值（58.77%）；60 mg/d的藥量能明顯減少小鼠腹腔腫瘤的數(shù)量、大小，明顯延長(zhǎng)小鼠壽命。 結(jié)論 該復(fù)方中藥對(duì)惡性腫瘤有一定的控制和治療作用，可以作為治療惡性腫瘤的藥物做進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 地丁豆根白術(shù)湯；惡性腫瘤；凋亡；小鼠

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）33-0025-03

中藥已經(jīng)被用到多種癌癥的治療過(guò)程中，包括中藥單體提取物[1]和復(fù)方中藥[2]。這些中藥在體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和皮下抑瘤方面有一定的作用[3]，但少有實(shí)際應(yīng)用上的報(bào)道，因而無(wú)法判斷其在實(shí)際應(yīng)用中的效果。深入考慮，當(dāng)前對(duì)于中藥治療腫瘤的研究方法似乎存在一些不合理之處。因?yàn)槿嗽谧匀粭l件下發(fā)生的類(lèi)似于小鼠皮下的腫瘤[4]尚未見(jiàn)報(bào)道，長(zhǎng)達(dá)24 h和48 h的中藥體外作用時(shí)間[1]過(guò)長(zhǎng)。我們知道口服中藥4 h左右就會(huì)達(dá)到最高血液濃度并且半衰期出現(xiàn)在其后的1～3 h內(nèi)[5]。因此，我們只有選取能在體外快速起效的藥物，才有可能在治療腫瘤的過(guò)程中有一個(gè)較好的效果。本研究使用辛同強(qiáng)醫(yī)生組配的地丁豆根白術(shù)湯復(fù)方中藥展開(kāi)研究。首先選取一個(gè)適宜的藥物濃度——在體外條件下，該濃度中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞（sp2/0）有明顯的殺傷作用，而對(duì)正常細(xì)胞（CEF）生長(zhǎng)情況影響較小。然后，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)研究該藥殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制。隨后進(jìn)行灌胃治療小鼠腹腔腫瘤試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1材料

雄性BALB/C小鼠購(gòu)自山東大學(xué)，sp2/0細(xì)胞和Hela細(xì)胞保存于本實(shí)驗(yàn)室，CEF細(xì)胞分離自SPF雞胚，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自嘉美生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有的細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 中藥提取物的制備 所有中藥組分在去離子水中浸泡4 h，用電磁爐中火煎煮2 h。水提取物3000 r/min離心10 min，用0.22 μm直徑的細(xì)菌濾器過(guò)濾，水浴蒸干水分，然后將提取物用無(wú)菌水溶解，調(diào)整濃度至30 mg/mL，并用0.22 μm直徑的細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌后保存于-20℃條件下備用。

1.2.3 細(xì)胞毒試驗(yàn) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CEF和sp2/0細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度，使各孔的細(xì)胞量為5×104。培養(yǎng)6 h后用含有0 mg/mL、0.6 mg/mL、1.2 mg/mL、2.4 mg/mL、4.8 mg/mL復(fù)方中藥的DMEM培養(yǎng)液替換原先的細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)藥物濃度設(shè)置四個(gè)重復(fù)組，其中0 mg/mL為對(duì)照。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，1000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞后，用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果用占對(duì)照組活細(xì)胞的百分比表示。

1.2.4 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 為進(jìn)一步確定該復(fù)方中藥殺傷細(xì)胞的機(jī)制，使用AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒對(duì)細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CEF細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度，使各孔的細(xì)胞量為5×105。培養(yǎng)6 h后用含有0 mg/mL、0.6 mg/mL、1.2 mg/mL、2.4 mg/mL、4.8 mg/mL復(fù)方中藥的DMEM培養(yǎng)液替換原先的細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)藥物濃度設(shè)置三個(gè)重復(fù)組，其中0 mg/mL為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，1000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用1×binding buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，用FITC標(biāo)記的Annexin Ⅴ避光染色5 min，隨后PI避光染色5 min，立即用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。根據(jù)CEF的細(xì)胞凋亡率選取最適藥物濃度，然后以此濃度的藥物分別作用于sp2/0細(xì)胞1 h、1.5 h、2 h、2.5 h測(cè)定腫瘤細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化。

1.2.5 小鼠同源腫瘤模型的建立及治療 12只五周齡的雄性BALB/C小鼠飼養(yǎng)于25℃條件下，采用自由取食取水的方式喂養(yǎng)。飼養(yǎng)1周后，每只小鼠腹腔注射5×106個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sp2/0細(xì)胞，混合培養(yǎng)24 h后，將小鼠隨機(jī)分成兩組，每組6只，其中一組為對(duì)照組，一組為實(shí)驗(yàn)組。60 mg/d的中藥提取物分3次通過(guò)灌胃的方式給予實(shí)驗(yàn)組的每只小鼠，時(shí)間間隔為6 h，對(duì)照組以同樣的方式灌胃等量的生理鹽水。待發(fā)病小鼠全部死亡7 d后，處死實(shí)驗(yàn)組未死亡小鼠。即時(shí)對(duì)兩組死亡小鼠進(jìn)行剖解，觀察腹腔內(nèi)腫瘤的大小、數(shù)量以及腫瘤所處的部位，同時(shí)記錄死亡小鼠的死亡時(shí)間。

1.2.6 Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗(yàn) 為了進(jìn)一步確定該復(fù)方中藥對(duì)人腫瘤細(xì)胞是否具有殺傷作用，我們選用Hela細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。采用不同濃度的復(fù)方中藥作用于Hela細(xì)胞24 h后，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件作分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組各單變量比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1復(fù)方中藥提取物對(duì)CEF和sp2/0細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

兩種細(xì)胞在含有不同濃度中藥提取物的DMEM中培養(yǎng)24 h。其中sp2/0細(xì)胞在2.4 mg/mL和4.8 mg/mL藥物濃度時(shí)全部死亡，而CEF的半數(shù)致死濃度為4.2 mg/mL，見(jiàn)圖1。封三圖1A和封三圖1B分別展示的是2.4 mg/mL藥物濃度下sp2/0和CEF的細(xì)胞形態(tài)，sp2/0的細(xì)胞形態(tài)明顯變差，而CEF幾乎沒(méi)有變化。兩種細(xì)胞平均存活率見(jiàn)表1，對(duì)于sp2/0細(xì)胞，各藥物濃度之間均有顯著差異，CEF細(xì)胞除4.8 mg/mL濃度外，其余濃度之間無(wú)明顯差異；在同一藥物濃度下CEF和sp2/0細(xì)胞間差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明該復(fù)方中藥具有明顯抗癌作用的同時(shí)也僅有較小的毒副作用。

2.2 細(xì)胞凋亡分析

CEF細(xì)胞在0 mg/mL、1.2 mg/mL、2.4 mg/mL、4.8 mg/mL的凋亡率分別為3.71%、4.09%、4.01%、13.29%（圖2）。根據(jù)CEF的細(xì)胞毒作用和凋亡分析，我們最終選用2.4 mg/mL的藥物濃度分別作用于sp2/0細(xì)胞1 h、1.5 h、2 h、2.5 h研究sp2/0細(xì)胞凋亡率的動(dòng)態(tài)變化。sp2/0的凋亡率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在2 h位點(diǎn)上，凋亡率為58.77%。該結(jié)果表明，本復(fù)方中藥確可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式殺傷腫瘤細(xì)胞（封三圖2）。

2.3動(dòng)物試驗(yàn)

我們通過(guò)腹腔注射sp2/0細(xì)胞的方式，建立小鼠同源腫瘤模型。對(duì)照組小鼠中，腫瘤出現(xiàn)于接種sp2/0后的12～14 d，小鼠的死亡時(shí)間也集中在19～21 d，腹腔中有溶血性腹水，腫瘤分布在肝臟、胃、腸等器官的表面及內(nèi)臟器官之間。然而，實(shí)驗(yàn)組的6只小鼠中有2只未發(fā)現(xiàn)腫瘤，其余4只發(fā)病小鼠的發(fā)病時(shí)間推遲到24～28 d，腫瘤分布于小鼠腹腔內(nèi)皮下，最終死亡時(shí)間也推遲到35～38 d。此外，對(duì)照組的大型腫瘤數(shù)量平均每只小鼠5.2個(gè)，小型腫瘤的數(shù)量難以數(shù)清，而實(shí)驗(yàn)組的發(fā)病小鼠除了平均每只小鼠1.25個(gè)的大型腫瘤外，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)小型腫瘤。圖3中可以看出對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組發(fā)病小鼠腹腔內(nèi)腫瘤的數(shù)量及大小。

2.4 復(fù)方中藥提取物對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

隨著藥物濃度的提高，Hela細(xì)胞的存活率明顯下降，表明該藥對(duì)人體腫瘤細(xì)胞仍然具有較強(qiáng)的殺傷作用（封三圖3）。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，人是一個(gè)有機(jī)整體，腫瘤是全身疾病的局部表現(xiàn)，它的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等都是人體正氣不足所致[6]，而腫瘤的病因主要是正氣虛損、氣滯血瘀、熱毒積聚、痰凝濕阻[7]。地丁豆根白術(shù)湯遵循“治病求本”[8]的原則，全方功效：健脾益氣，活血行氣、祛瘀止痛、清熱解毒、燥濕化痰、消腫散結(jié)。方中，白術(shù)等健脾益氣；川芎、丹參活血行氣，祛瘀止痛；蒲公英、山豆根、白花蛇舌草清熱解毒，消腫散結(jié)；茯苓、天南星等燥濕化痰，利水滲濕[9]。

本研究首次選用快速起效的研究思路，通過(guò)體外、體內(nèi)及人體試驗(yàn)對(duì)該復(fù)方中藥治療惡性腫瘤的效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。在體外，我們選用不同濃度的藥物分別作用于正常細(xì)胞CEF和小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0，sp2/0細(xì)胞在藥物濃度達(dá)到2.4 mg/mL時(shí)即全部死亡，而CEF在這一藥物濃度下無(wú)明顯的變化。在機(jī)制方面，考慮到口服中藥在體內(nèi)的代謝時(shí)間，我們首先用不同濃度的復(fù)方中藥提取物作用CEF細(xì)胞2 h，然后根據(jù)CEF的凋亡率及sp2/0細(xì)胞在前一試驗(yàn)的存活率，最終選定2.4 mg/mL為研究sp2/0細(xì)胞死亡機(jī)制的最適濃度。為了獲得腫瘤細(xì)胞凋亡率的動(dòng)態(tài)變化，我們選用給藥后不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)sp2/0細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行測(cè)定。凋亡率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有先上升后下降的趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在2 h處，為58.77%。凋亡率下降的原因可能是，晚期凋亡的細(xì)胞形成凋亡小體，因此這部分細(xì)胞在流式細(xì)胞儀上不能夠被檢測(cè)出來(lái)。這一結(jié)論可以在封三圖2中得到證實(shí)，在2.5 h時(shí)間點(diǎn)上的被檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)明顯低于對(duì)照組，而這部分細(xì)胞可能是形成凋亡小體的晚期凋亡細(xì)胞。這一結(jié)論也與Nancy1998年在《Science》上發(fā)表的研究成果相一致，即細(xì)胞凋亡從開(kāi)始到形成凋亡小體被吞噬細(xì)胞吞噬的整個(gè)過(guò)程是在30～60 min內(nèi)完成[10]。我們也由此得出該復(fù)方中藥可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式殺傷腫瘤細(xì)胞。

在體內(nèi)，出于對(duì)癌細(xì)胞是自身細(xì)胞的變異，雖然跟正常細(xì)胞存在差異，但同時(shí)也與正常細(xì)胞有很多相似之處，以及原發(fā)性腫瘤大部分位于內(nèi)臟器官表面或內(nèi)部而并非位于皮下等諸多方面的考慮，我們最終選擇腹腔注射sp2/0細(xì)胞的方式建立BALB/C小鼠的同源腫瘤模型。在我們的研究中，相對(duì)于對(duì)照組小鼠，實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)過(guò)治療后腫瘤細(xì)胞的數(shù)量明顯降低，其中2只小鼠未發(fā)現(xiàn)腫瘤。結(jié)果提示，該復(fù)方中藥能抑制腫瘤的形成與生長(zhǎng)。為了探究復(fù)方中藥對(duì)人腫瘤細(xì)胞的作用，我們開(kāi)展了該藥對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗(yàn)，同時(shí)該復(fù)方中藥對(duì)人腫瘤細(xì)胞的殺傷作用亦得已證實(shí)。

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（收稿日期：2015-09-07）