李永興 陶學(xué)芳 尉理梁

[摘要] 目的 探討結(jié)核菌特異性Elispot檢測IFN-γ對肺結(jié)核病診斷及其治療的指導(dǎo)意義。 方法 選擇我院2011年1月～2014年12月收治的肺結(jié)核患者100例，所有患者入組期間均采用住院觀察，并持續(xù)住院時間均在3 d以上，先行Elispot檢測，1 d后行PPD實驗，比較確診患者Elispot檢測結(jié)果與PPD實驗結(jié)果、Elispot檢測陽性與陰性結(jié)果中斑點形成細胞數(shù)與Elispot檢測卡介苗接種前后IFN-γ分泌水平。 結(jié)果 卡介苗接種前后IFN-γ分泌中ESAT-6水平和PoolA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），Elispot檢測陽性結(jié)果中斑點形成細胞數(shù)顯著多于陰性（P<0.05），Elispot檢測法的陽性率為88.0%，靈敏度為90.5%，特異度為19.2%，PPD實驗的陽性率為74.0%，靈敏度為76.1%，特異度為41.7%，Elispot檢測法陽性率和靈敏度均高于PPD實驗（P<0.05）。 結(jié)論 結(jié)核菌特異性IFN-γ Elispot檢測對于篩查肺結(jié)核感染患者具有明顯優(yōu)勢，其不受接種卡介苗與否的影響，其陽性率和敏感性均顯著高于常規(guī)PPD試驗。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核菌特異性；Elispot檢測；IFN-γ；肺結(jié)核

[中圖分類號] R52 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）33-0021-04

研究顯示，我國人群中被結(jié)核菌感染的比例在30%以上，而超過90%人群在結(jié)核菌感染后并不出現(xiàn)核感染的臨床癥狀[1]。進入新世紀后，我國進行的結(jié)核病大樣本普查發(fā)現(xiàn)，隨著生活質(zhì)量的改善和醫(yī)療水平的提高，結(jié)核感染率有所下降，但仍有接近50%的人群被結(jié)核所感染。也就是說，健康人群中存在大量的結(jié)核桿菌潛伏感染者，加上感染后發(fā)病者，我國結(jié)核病疫情已較為嚴重[2]。目前針對該部分結(jié)核感染初診上最主要的方法是結(jié)核菌素試驗（也稱為芒圖試驗、PPD試驗），該試驗中許多患者雖然PPD試驗陽性，但仍無臨床癥狀，處于潛伏期，所以PPD試驗在臨床中對于區(qū)分真正結(jié)核感染者效果有限[3]。本研究主要探討結(jié)核菌特異性Elispot檢測IFN-γ對活動性肺結(jié)核病診斷及其治療效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2011年1月～2014年12月收治的肺結(jié)核患者100例，所有患者均符合以下診斷標準：①具有典型的肺結(jié)核臨床癥狀或胸部X射線檢查明確的肺結(jié)核病灶；②痰液或支氣管灌洗液涂片行抗酸染色結(jié)果陽性；③痰液或支氣管灌洗液測定結(jié)核分枝桿菌體外培養(yǎng)結(jié)果陽性；④痰內(nèi)聚合反應(yīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌DNA片段；⑤芒圖試驗強陽性，患者體內(nèi)存在血清抗結(jié)核抗體且檢查結(jié)果為陽性；⑥排除非結(jié)核性肺部疾病；⑦規(guī)律抗結(jié)核治療患者臨床癥狀、實驗室檢查、影像學(xué)檢查均得到改善。符合①與⑦以及②～⑥中兩項以上者。其中男46例，女54例，年齡18～50歲，平均（42.3±2.1）歲，肺結(jié)核病程1～20年，平均（6.3±1.2）年，肺結(jié)核類型：原發(fā)性肺結(jié)核（Ⅰ型）者19例，血行播散型肺結(jié)核（Ⅱ型）者26例，繼發(fā)型肺結(jié)核（Ⅲ型）者55例。

1.2 實驗方法

1.2.1 結(jié)核菌特異性 IFN-γ體外檢測 收集通過乙二胺四乙酸進行抗凝后的晨起患者肘靜脈血5 mL，使用Ficoll法對外周淋巴細胞進行分離，并采用Elispot法進行檢測。所有患者于采血后2 h內(nèi)對標本進行外周血單個核細胞分離。對分離細胞活化后將其包被于抗體平板上，每孔注入100 μL，保持每孔的細胞濃度達到2×105個以上，之后加入結(jié)核菌重組蛋白抗原（ESAT-6）、PoolA及卡介苗，保持終濃度為5 μg每孔。隨后蓋上板蓋，放置于37℃、5%二氧化碳溫箱培養(yǎng)持續(xù)24 h。之后進行洗板，并加入待檢測抗體，37℃條件下孵化1 h，再次洗板并加入親和素孵化1 h。最后添加顯色劑進行顯色后最后洗板，計數(shù)Elispot斑點及其參數(shù)，以上所有操作均由具有5年以上工作經(jīng)驗的同一實驗師嚴格按照說明書進行。采用酶聯(lián)免疫斑點讀板儀對斑點形成細胞數(shù)進行自動檢測。結(jié)果判斷：陽性：質(zhì)控孔內(nèi)斑點形成細胞數(shù)遍布整個反應(yīng)孔，陰性為質(zhì)控孔內(nèi)存在5個以內(nèi)斑點形成細胞數(shù)。

1.2.2 PPD試驗 每例患者均使用2個國際結(jié)核菌素單位，約0.1 mL由同一護士選擇患者前臂內(nèi)側(cè)皮膚進行皮內(nèi)注射，持續(xù)觀察15 min后可自行活動，于3 d后觀察結(jié)果，詳細記錄硬結(jié)的直徑，質(zhì)地、顏色、有無紅腫破潰等。

1.2.3 卡介苗接種 選擇患者左上臂三角肌外側(cè)下緣進行卡介苗的皮內(nèi)注射，劑量為0.1 mL，所含菌量為0.5～0.75 mg。

1.2.4 主要試劑 Elispot試劑由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物實驗中心研制，結(jié)核菌素由成都生物制品研究所提供，包被抗體和檢測抗體均由eBioscience公司生產(chǎn)，酶聯(lián)二抗由PierceBiotechonology公司生產(chǎn)，結(jié)核菌重組蛋白抗原（ESAT-6）由本院檢驗科制備，卡介苗由上海生物制品研究所提供。

1.3 觀察指標

對所有患者入組前均簽署知情同意書，并申報醫(yī)院倫理委員會批準，根據(jù)入組標準確診后抽取患者肘靜脈血5 mL備用，所有患者入組期間均采用住院觀察，并持續(xù)住院時間均在3 d以上，比較確診患者Elispot檢測結(jié)果與PPD實驗結(jié)果，Elispot檢測陽性與陰性結(jié)果中斑點形成細胞數(shù)與Elispot檢測卡介苗接種前后IFN-γ分泌水平。所有患者均先進行Elispot檢測，1 d后行PPD實驗。靈敏度=真陽性人數(shù)/（真陽性人數(shù)+假陰性人數(shù)）×100%，特異度=真陰性人數(shù)/（真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，四格表資料采用四格表χ2檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Elispot檢測卡介苗接種前后IFN-γ分泌水平

卡介苗接種前后IFN-γ分泌中ESAT -6水平和PoolA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 Elispot檢測陽性與陰性結(jié)果中斑點形成細胞數(shù)及比較

Elispot檢測陽性結(jié)果中斑點形成細胞數(shù)顯著多于陰性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 100例確診患者Elispot檢測結(jié)果與PPD實驗結(jié)果比較

Elispot檢測法的陽性率為88.0%（88/100），靈敏度為90.5%（67/74），特異度為19.2%（5/26），PPD實驗的陽性率為74.0%（74/100），靈敏度為76.1%（67/88），特異度為41.7%（5/12），Elispot檢測法陽性率和靈敏度均高于PPD實驗，兩種檢查方法差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.811，P=0.026）。見表3。

3 討論

我國屬于發(fā)展中國家，結(jié)核菌感染是一種嚴重危害人群生命健康的公共衛(wèi)生問題[4]，是國家衛(wèi)生工作不容忽視重點需要防控的傳染性疾病[5]。如何更有效地對結(jié)核病患者進行早期的診斷、篩查以指導(dǎo)治療是防治結(jié)核病的重要手段[6]。其中結(jié)核菌素試驗作為目前臨床上唯一用于檢測結(jié)核潛伏感染的方法，因其敏感性偏低，且存在加大的假陽性率而不被臨床看好[7]。

目前使用IFN-γ檢測代替PPD試驗是研究熱點，早在2005年，美國疾病控制及預(yù)防中心就已明確酶聯(lián)免疫斑點法（Elispot）檢測IFN-γ的臨床價值，并規(guī)定其應(yīng)用范圍，尤其是針對移民人群、醫(yī)務(wù)工作者、有結(jié)核感覺密切接觸史者[8]。作為結(jié)核病診斷及治療后效果評估中的主要細胞免疫學(xué)檢測手段[9]。其有效結(jié)合細胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)兩者之長處，有效分析特異性抗原活化后的分泌型細胞因子，尤其是IFN-γ單個效應(yīng)細胞的頻數(shù)，從而更敏感的特異性鑒定結(jié)核桿菌。Elispot檢測是通過再次刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)的同種抗原引起的致敏反應(yīng)，促使記憶性T淋巴細胞釋放IFN-γ，被認為是記憶性T淋巴細胞近期內(nèi)暴露于結(jié)核抗原的有效指標[10]。肺結(jié)核患者免疫發(fā)病機制主要因T淋巴細胞介導(dǎo)細胞免疫改變所致。多數(shù)學(xué)者認為疫苗接種后所誘導(dǎo)的抗原特異性多功能T淋巴細胞可顯著控制結(jié)核分枝桿菌感染及患者的病情[11]。尤其是Th1類細胞因子，如IFN-γ發(fā)揮十分重要的臨床作用[12]。IFN-γ可反映T淋巴細胞的功能，其所產(chǎn)生非細胞損傷性病毒清除細胞因子在結(jié)核病患者的免疫應(yīng)答中發(fā)揮積極作用[13]。另外，酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)則是上世紀80年代應(yīng)用于實踐，通過單細胞水平檢測特異性抗體所分泌細胞及特異性細胞因子分泌細胞的免疫技術(shù)，其穩(wěn)定性強、敏感性和特異性均較高[14]。近年來已將其應(yīng)用于免疫系統(tǒng)疾病的檢測，其中針對結(jié)核病患者機體免疫功能的測定，以更好地指導(dǎo)臨床治療而受到臨床重視。有研究稱[15]，與以往常用的PPD試驗比較，結(jié)核菌抗原特異性IFN-γ水平檢測具有兩大優(yōu)勢，其一，具有較高的敏感性與特異性，而且不受接種卡介苗與否的影響[16]；其二，該實驗可一次實驗即得結(jié)果，無需受試者多次來院進行結(jié)果的判斷，減少了患者不必要的麻煩[17]。

本組對患者進行Elispot檢測與PPD實驗，發(fā)現(xiàn)Elispot檢測法陽性率和靈敏度均高于PPD實驗（P<0.05）。PPD試驗屬于機體對結(jié)核菌素純蛋白衍化物發(fā)生的一種遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，其主要的缺點為PPD可能混雜有除結(jié)核分枝桿菌外的非結(jié)核分枝桿菌等多種抗原[18]。尤其是PPD實驗對于接種卡介苗后患者亦存在敏感性，患者將出現(xiàn)陽性反應(yīng)，故進行PPD試驗者除受結(jié)核分枝桿菌感染外還有可能是因接種卡介苗所致。而Elispot檢測則是利用多種混合性特異抗原多肽[19]，其中關(guān)鍵是ESAT-6和PoolA為主的混合抗原，臨床應(yīng)用特異性顯著優(yōu)于PPD試驗。

本組選擇ESAT-6和PoolA抗原進行研究，無論接種卡介苗與否，其ESAT-6和PoolA抗原水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），可認為以上兩種抗原多肽所誘導(dǎo)的IFN-γ水平變化不受接種卡介苗與否的影響，證實Elispot檢測IFN-γ水平可有效避免接種卡介苗對其影響。針對100例Elispot檢測患者而言，其陽性結(jié)果中斑點形成細胞數(shù)顯著多于陰性（P<0.05）。雖然所有患者均確診患有肺結(jié)核，但因結(jié)核蛋白來源不同，其長度與氨基酸排列順序存在差異，故陽性患者斑點形成細胞數(shù)多于陰性者。而且針對規(guī)律治療患者，治療前其IFN-γ分泌水平一般較高，隨者治療的進行以及患者病情的好轉(zhuǎn)，IFN-γ分泌水平逐漸下降[20]。

綜上所述，結(jié)核菌特異性IFN-γ Elispot檢測對于篩查肺結(jié)核感染患者具有明顯優(yōu)勢，其不受接種卡介苗與否的影響，其陽性率和敏感性均顯著高于常規(guī)PPD試驗。

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（收稿日期：2015-07-17）