關(guān)建義　毛會(huì)麗　賀文旭　楊利敏　符運(yùn)棟　張敬梅　吳佳靜　寧黔冀

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007)

[摘　要]　目的：選取毒力因子多、毒性強(qiáng)的嗜水氣單胞菌株(Aeromonas hydrophil)制成滅活疫苗，研究疫苗的免疫保護(hù)效果。方法：采用甲醛滅活制備疫苗，對(duì)銀鯽進(jìn)行腹腔注射，設(shè)立免疫組和對(duì)照組，然后進(jìn)行血清抗體效價(jià)檢測(cè)、病理切片分析和攻毒保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果：銀鯽在經(jīng)注射免疫后，各免疫時(shí)間均有抗體產(chǎn)生，抗體效價(jià)在第6周檢測(cè)時(shí)達(dá)到高峰，而對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中均沒(méi)有檢測(cè)到抗體；病理切片也表明，該疫苗能夠?qū)a魚靶器官產(chǎn)生很好的保護(hù)作用；攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，免疫組的免疫保護(hù)率達(dá)100%，且免疫保護(hù)期長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月以上。結(jié)論：嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)銀鯽有顯著的免疫保護(hù)效應(yīng)，可作為預(yù)防細(xì)菌性敗血癥感染的疫苗。

[關(guān)鍵詞]　嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophil)；疫苗；抗體效價(jià)；病理切片；免疫保護(hù)率

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.013

豫北地區(qū)嗜水氣單胞菌滅活疫苗的制備及免疫效果的研究①

關(guān)建義毛會(huì)麗②賀文旭②楊利敏②符運(yùn)棟②張敬梅②吳佳靜②寧黔冀

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007)

[摘要]目的：選取毒力因子多、毒性強(qiáng)的嗜水氣單胞菌株(Aeromonas hydrophil)制成滅活疫苗，研究疫苗的免疫保護(hù)效果。方法：采用甲醛滅活制備疫苗，對(duì)銀鯽進(jìn)行腹腔注射，設(shè)立免疫組和對(duì)照組，然后進(jìn)行血清抗體效價(jià)檢測(cè)、病理切片分析和攻毒保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果：銀鯽在經(jīng)注射免疫后，各免疫時(shí)間均有抗體產(chǎn)生，抗體效價(jià)在第6周檢測(cè)時(shí)達(dá)到高峰，而對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中均沒(méi)有檢測(cè)到抗體；病理切片也表明，該疫苗能夠?qū)a魚靶器官產(chǎn)生很好的保護(hù)作用；攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，免疫組的免疫保護(hù)率達(dá)100%，且免疫保護(hù)期長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月以上。結(jié)論：嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)銀鯽有顯著的免疫保護(hù)效應(yīng)，可作為預(yù)防細(xì)菌性敗血癥感染的疫苗。

[關(guān)鍵詞]嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophil)；疫苗；抗體效價(jià)；病理切片；免疫保護(hù)率

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.013

中圖分類號(hào)①本文為河南省基礎(chǔ)與前言技術(shù)研究項(xiàng)目(142300410021)、河南省科技廳科技攻關(guān)(132102310165)、河南省教育廳科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(2011A240001)和2013年國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新課題(201310472007)。;②新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,新鄉(xiāng)453003。

作者簡(jiǎn)介：關(guān)建義(1969年-)，男，副教授，主要從事魚類病害研究，同時(shí)就職于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，E-mail:jianyiguan@163.com。

通訊作者及指導(dǎo)教師：寧黔冀(1964年-)，女，博士，教授，主要從事動(dòng)物生長(zhǎng)及細(xì)胞免疫學(xué)方面的研究，E-mail:ningqianji1964@163.com。

[Abstract]Objective:Selected virulence factors more than and high virulent Aeromonas hydrophia strain made into inactivated vaccine,to study the immunization effect of inactivated vaccine.Methods: Crucian were vaccinated with formalin-killed vaccine via intraperitoneal injection.Controls were injected with the same volumes of saline.Then the antibody titres,histopathology and relative percent survival were analyzed from samples of both groups.Results: The antibody in the indirect agglutination reaction could be detected in vaccinated fish once a weeks after immunization and reached highest level 6 weeks after immunization.The histopathology analysis indicated that the vaccine had a good protective effect on crucian target organs.Vaccinated fish showed 100% relative percent survival and the immune period would be 6 month.Conclusion: The vaccine in this study has a significant protective effect on crucian and may be used as effective fish vaccines against bacterial septicemia.

Preparation of a deactivation vaccine against Aeromonas hydrophila and research about its immue effect in the north of Henan

GUANJian-Yi,MAOHui-Li,HEWen-Xu,YANGLi-Min,FUYun-Dong,ZHANGJing-Mei,WUJia-Jing,NINGQian-Ji.CollegeofLifeSciences,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007,China

[Key words]Aeromonas hydrophia;Vaccine;Antibody titers;Tissue slices;Immunization protection rate

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila) 廣泛存在于淡水、土壤、污水、淤泥和糞便中，包括有致病性菌株和非致病性菌株兩類[1]，致病性菌株感染譜十分廣泛，可引起鱉、蝦、蟹、蛙、鴨、貂等[2,3]的爆發(fā)感染，是引起水產(chǎn)生物病害的重要病原體[4-7]，人類感染此菌可引起軟組織損傷和食物中毒[8]，是一種典型人-獸-魚共患病病原[9-11]。防治嗜水氣單胞菌的方法主要包括抗生素防治和疫苗防治2種方法?？股氐膹V泛使用和濫用，加上監(jiān)管措施不嚴(yán)，導(dǎo)致嗜水氣單胞菌產(chǎn)生了耐藥性甚至多重耐藥性[12]。目前，研究嗜水氣單胞菌全菌滅活疫苗對(duì)控制嗜水氣單胞菌感染魚類具有重要意義，全菌滅活疫苗是指利用某種方式滅活烈性野生病原菌的感染性，但保留其免疫原性而制備的疫苗[13-15]。

本研究從新鄉(xiāng)地區(qū)自然患細(xì)菌性敗血癥的病例中分離出強(qiáng)毒株，制成全菌滅活疫苗，檢查其安全性后，以腹腔注射方式進(jìn)行接種免疫，觀察對(duì)銀鯽的免疫保護(hù)情況，旨在為全菌滅活疫苗在本地區(qū)魚病防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料試驗(yàn)菌株：嗜水氣單胞菌菌株，自新鄉(xiāng)市患細(xì)菌性敗血病的病魚體內(nèi)分離，本實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

試驗(yàn)動(dòng)物：健康銀鯽購(gòu)自新鄉(xiāng)市郊某漁場(chǎng)，每條魚質(zhì)量約為(30±2)g，長(zhǎng)度為12～15 cm。使用前先于實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)1周，充氣，控制水溫28℃左右，定期清污換水、喂食。

實(shí)驗(yàn)儀器： 恒溫震蕩培養(yǎng)箱(設(shè)備編號(hào)ZHWY-2102)；TG-16型微量高速離心機(jī)； 水族箱；冰凍切片機(jī)(德國(guó)產(chǎn))； NikonE400型顯微鏡。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1疫苗菌株的篩選實(shí)驗(yàn)室保存的菌株活化后，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯28℃搖床培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)物利用血小球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每株菌的試驗(yàn)組分5組，每組10尾魚，將菌液以10-1、10-2、10-3、10-4倍比稀釋，每稀釋度菌液腹腔注射銀鯽，每尾注射0.2 ml,同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照。實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)于已消過(guò)毒的水族箱里，自來(lái)水已曝氣24 h，充氣，控制水溫28℃左右，定期清污換水、投喂食物。每天記錄每組魚的死亡情況，參考Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)致死濃度(LD50)，選出LD50最低的菌株為疫苗菌株。

1.2.2全菌滅活疫苗的制備將疫苗菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯28℃搖床培養(yǎng)16 h后，10 000 r/min離心20 min，收集菌體，加入磷酸緩沖液(PBS)至細(xì)菌濃度為1×108cfu/ml，然后加入終濃度為0.2%的甲醛溶液，28℃搖床培養(yǎng)24 h，制得嗜水氣單胞菌的滅活疫苗。

1.2.3疫苗無(wú)菌檢測(cè)與安全性試驗(yàn)取上述制備的疫苗涂布平板，28℃培養(yǎng)48 h，觀察有無(wú)菌落出現(xiàn)。取上述制備的疫苗腹腔注射銀鯽30尾，每尾注射0.2 ml，觀察試驗(yàn)銀鯽的反應(yīng)和死亡情況。

1.2.4銀鯽的免疫接種試驗(yàn)組和對(duì)照組各80尾銀鯽，試驗(yàn)組腹腔注射全菌滅活溶液，每尾注射0.2 ml；對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水。每天充氣，投喂食物，水溫控制在28℃左右。

1.2.5血清抗體動(dòng)態(tài)檢測(cè)銀鯽免疫后，每周從各組魚中隨機(jī)取5尾，注射器尾動(dòng)脈/靜脈取血，血液收集于離心管，使其4℃下自然沉降，分離血清，檢測(cè)到免疫后第6個(gè)月。96孔板每孔加入生理鹽水50 μl后,分別加入2倍比稀釋免疫魚血清和對(duì)照魚血清，然后加入滅活的嗜水氣單胞菌菌液作為抗原，培養(yǎng)板于28℃恒溫箱1 h，再放入4℃冰箱過(guò)夜后判定結(jié)果。

1.2.6病理切片分析銀鯽免疫21 d后，隨機(jī)挑取試驗(yàn)組和對(duì)照組的魚，以50LD50嗜水氣單胞菌攻擊，12 h后解剖取其肝臟、脾臟、腎臟以及腸道組織固定，包埋，經(jīng)冰凍切片機(jī)切片，HE染色，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封存后，于光學(xué)顯微鏡下觀察并對(duì)比試驗(yàn)組與對(duì)照組中魚各組織器官的變化。

1.2.7攻毒保護(hù)試驗(yàn)在首次免疫21 d后，每組隨機(jī)挑取30尾魚，以50LD50嗜水氣單胞菌攻擊，同樣采取腹腔注射的方式，同樣環(huán)境下培養(yǎng)10 d，每天觀察并記錄各組死亡數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算魚的免疫保護(hù)率：免疫保護(hù)(%)=(對(duì)照組魚種死亡率-實(shí)驗(yàn)組魚種死亡率)/對(duì)照組魚種死亡率×100%。

1.2.8免疫保護(hù)期的測(cè)定在首次免疫6個(gè)月后，每組隨機(jī)挑取30尾魚，仍以50LD50嗜水氣單胞菌攻擊，同樣環(huán)境下培養(yǎng)10 d，每天觀察并記錄各組死亡數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算魚的免疫保護(hù)率。

2結(jié)果

2.1疫苗菌株的篩選試驗(yàn)試驗(yàn)菌株活化后，進(jìn)行了半致死濃度LD50的測(cè)定。根據(jù)攻毒試驗(yàn)中，每組銀鯽的死亡情況，并結(jié)合各菌株毒力因子的特點(diǎn)，篩選出了毒力因子多、毒性強(qiáng)的菌株作為疫苗制備備用菌株：XDMC(1)，其LD50為1.5×105cfu/ml。

2.2疫苗無(wú)菌檢測(cè)和安全性試驗(yàn)試驗(yàn)用滅活疫苗涂布平板培養(yǎng)48 h后，無(wú)菌落出現(xiàn)，證明疫苗滅活完全。動(dòng)物安全實(shí)驗(yàn)中，疫苗注射銀鯽后均無(wú)異常反應(yīng)，證明疫苗是安全無(wú)毒性的。

2.3血清抗體檢測(cè)每組魚血清凝集抗體效價(jià)如圖1所示。免疫后不同時(shí)間，免疫組銀鯽平均抗體效價(jià)始終明顯高于對(duì)照組，銀鯽經(jīng)注射免疫后，能產(chǎn)生較高的抗體效價(jià)，免疫組每周的抗體效價(jià)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，在第6周時(shí)抗體效價(jià)達(dá)到高峰(1∶1 024)，約為對(duì)照組的10倍左右，且能維持3周左右，在第24周時(shí)抗體效價(jià)仍能達(dá)到1∶256，約是對(duì)照組的8倍左右。

圖1　血清抗體效階Fig.1　Average serum antibody titerNote: Within the same time,different letters indicate significant difference (P<0.05).

圖2　魚的肝臟、脾臟、腎臟和腸道的組織切片照片(×200)Fig.2　Photos of histopathologic slices with from fish liver,spleen,kidney and intestinal tissue(×200)Note: A,B,C and D were photos of histopathologic slices with HE staining from fish liver,spleen,kidney and intestine respectively in experimental group.E,F,G and H were photos of histopathologic slices with HE staining from fish liver,spleen,kidney and intestine respectively in control group.

2.4病理切片分析試驗(yàn)組與對(duì)照組病理切片見(jiàn)圖2。圖2A為免疫組魚肝細(xì)胞可見(jiàn)肝細(xì)胞呈多角狀，排列均勻有規(guī)則 (箭頭所示)；圖2B為免疫組魚脾臟可見(jiàn)脾實(shí)質(zhì)紅髓與白髓相間排列，無(wú)明顯的分界，網(wǎng)狀組織中充滿著不同發(fā)育階段的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等(箭頭所示)；圖2C為免疫組魚腎臟，可見(jiàn)其形態(tài)大小正常，皮髓質(zhì)界限清晰，腎竇無(wú)分離，腎小管正常(箭頭所示)；圖2D為免疫組魚腸道組織，上皮組織細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、黏膜內(nèi)層、黏膜下層細(xì)胞形態(tài)正常(箭頭所示)；圖2E為對(duì)照組魚的肝臟，肝細(xì)胞包漿疏松且出現(xiàn)明顯氣球樣變性，后期出現(xiàn)大量的肝細(xì)胞壞死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，紅細(xì)胞腫大、破裂、溶解，毛細(xì)血管、小血管破損，管壁扁平，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，變性，嚴(yán)重溶血，可見(jiàn)棕黃色血源性色素沉積(箭頭所示)；圖2F為對(duì)照組魚的脾臟，可見(jiàn)脾臟紅髓與白髓難以辨認(rèn)，小體結(jié)構(gòu)不清，組織細(xì)胞大量溶解、壞死、血源性色素沉積最為顯著(箭頭所示)；圖2G為對(duì)照組魚的腎臟，可見(jiàn)腎小體壞死，腎小球囊腔變大，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性、壞死、崩解(箭頭所示)；圖2H為對(duì)照組魚的腸道，可見(jiàn)腸絨毛壞死、脫落，腸絨毛上皮細(xì)胞壞死、脫落，杯狀細(xì)胞大量增生(箭頭所示)。說(shuō)明疫苗對(duì)鯽魚產(chǎn)生了保護(hù)作用，當(dāng)嗜水氣單胞菌侵入魚體內(nèi)時(shí)，魚的免疫系統(tǒng)可識(shí)別并消滅病原菌，以免細(xì)菌對(duì)組織造成損傷。

2.5攻毒保護(hù)試驗(yàn)滅活疫苗對(duì)銀鯽的攻毒保護(hù)試驗(yàn)(見(jiàn)表1)顯示，該疫苗能對(duì)鯽魚產(chǎn)生很好的保護(hù)作用，其免疫保護(hù)率達(dá)到了100%；未免疫的對(duì)照組銀鯽全部死亡，從死魚內(nèi)臟中回收到攻毒株。

表1　免疫后3周的免疫保護(hù)力Tab.1　Relative percent survival 3 weeks after immunization

表2　免疫后6個(gè)月的免疫保護(hù)力Tab.2　Relative percent survival 6 months after immunization

2.6免疫保護(hù)期的測(cè)定6個(gè)月后的免疫保護(hù)結(jié)果顯示(見(jiàn)表2)，該疫苗免疫保護(hù)率仍高達(dá)97%，而未免疫的對(duì)照組銀鯽全部死亡，從死魚內(nèi)臟中回收到攻毒株，說(shuō)明該疫苗對(duì)銀鯽的免疫保護(hù)期長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月以上。

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用甲醛滅活的方法制備嗜水氣單胞菌滅活疫苗，既滅活烈性野生病原菌的感染性，又保留其免疫原性[14]，并用此疫苗來(lái)免疫銀鯽，且采用的是毒力因子最多，毒性最強(qiáng)的菌株作為疫苗菌株，所以能對(duì)更多種強(qiáng)毒株產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。血清抗體檢測(cè)試驗(yàn)說(shuō)明，魚類雖然是較低等的脊椎動(dòng)物，特異性免疫機(jī)制還很不完善，但在嗜水氣單胞菌免疫反應(yīng)中，產(chǎn)生了抗體，特異性免疫發(fā)揮了重要作用。從病理切片可以看出，嗜水氣單胞菌可以侵入魚的肝臟、脾臟、腎臟、腸道等組織，并造成嚴(yán)重的損傷，疫苗可以在細(xì)菌進(jìn)入這些組織之前將其殺滅，很好的保護(hù)了魚體的安全。從攻毒保護(hù)試驗(yàn)可以看出，該全菌滅活疫苗可以產(chǎn)生很好的保護(hù)力。但是，該疫苗也存在很大的局限性，由于嗜水氣單胞菌血清型眾多，不同地區(qū)、不同魚種之間分離的菌株差異顯著，導(dǎo)致至今嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫效果不佳。本研究采用本地分離的嗜水氣單胞菌制備滅活疫苗應(yīng)用于本地養(yǎng)殖場(chǎng)所，取得了較好的保護(hù)效果。但所制備的滅活疫苗仍然面臨著應(yīng)用范圍狹窄的問(wèn)題。解決這一問(wèn)題還需要進(jìn)一步從基因方面入手，選擇各菌株間變異系數(shù)較小的致病基因構(gòu)建基因工程疫苗或核酸疫苗，擴(kuò)大疫苗的應(yīng)用范圍。因此，開(kāi)發(fā)新型疫苗以針對(duì)多種血清型菌株仍是今后防治嗜水氣單胞菌引起疾病的重要方向。

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[收稿2015-04-25修回2015-05-20]

(編輯倪鵬)