石慶強(qiáng)　左國偉　馮子強(qiáng)　趙綠翠　羅　念　游智梅　夏　菁　李丹陽　李　靜　陳地龍

(重慶北部新區(qū)第一人民醫(yī)院急診科，重慶401121)

①本文為國家自然科學(xué)基金(31271368)和重慶市教委基金(KJ110308)。

②重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實驗室，重慶400016。

③重慶醫(yī)科大學(xué)，組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，干細(xì)胞與組織工程研究室，重慶400016。

陳地龍(1971年-)，男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥對腫瘤的抑制作用方面的研究，E-mail: chendilong@21cn.com。

[摘　要]　目的：研究人參皂苷Rh2對HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制。方法：用pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒感染HepG2細(xì)胞，運(yùn)用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化。通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖反應(yīng)。采用FCM檢測細(xì)胞周期及凋亡變化；利用ELISA法檢測細(xì)胞產(chǎn)生Gsk-3β活性；用PCR法檢測細(xì)胞Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表達(dá)；用CHIP法檢測細(xì)胞Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表達(dá)；運(yùn)用Western blot法檢測細(xì)胞Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3蛋白的表達(dá)。結(jié)果：用pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒感染HepG2細(xì)胞，被感染的HepG2細(xì)胞命名為HepG2-β-catenin；CCK-8分析結(jié)果顯示，加藥組給予(10~160 μmol/L)Rh2后HepG2及HepG2-β-catenin細(xì)胞的增殖受到抑制，且Rh2對肝癌HepG2-β-catenin和HepG2細(xì)胞的生長抑制呈劑量和時間依賴。在HepG2細(xì)胞中48、72 h 半數(shù)抑制率分別為100 μmol/L,58.12 μmol/L，在HepG2-β-catenin細(xì)胞中48、72 h半數(shù)抑制率分別是129.2 μmol/L，83.33 μmol/L，故Rh2作用于HepG2-β-catenin細(xì)胞濃度均高于HepG2細(xì)胞,與HepG2細(xì)胞組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。FCM檢測結(jié)果顯示，Rh2可誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，HepG2+ Rh2組G0/G1期(64.57±0.65)，而HepG2-β-catenin+ Rh2組G0/G1期(58.61±2.01)；FCM檢測結(jié)果顯示，Rh2可誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞早期凋亡，HepG2+ Rh2組凋亡率(17.27±2.77)，而HepG2-β-catenin+ Rh2組凋亡率(9.02±1.76)。ELISA結(jié)果顯示，Rh2作用HepG2細(xì)胞12、24、48、72 h后，Gsk-3β的活性隨著作用時間延長，逐漸升高，在48 h最高，隨后其活性開始降低。Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞48 h，與對照組相比，Gsk-3β的活性均增高，而加入Bio后其活性降低，HepG2+ Rh和HepG2-β-catenin+ Rh2組間無明顯差異；PCR、CHIP、WB結(jié)果顯示，人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞后,Gsk-3β、Bax基因及蛋白表達(dá)增加，而β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3基因及蛋白表達(dá)水平下調(diào)。與HepG2-β-catenin+Rh2組相比,HepG2+Rh2組除Gsk-3β外各基因及蛋白的表達(dá)變化更為顯著。結(jié)論：過表達(dá)β-catenin可削弱人參皂苷Rh2對肝癌HepG2細(xì)胞的藥理作用。人參皂苷Rh2通過激活Gsk-3β降解β-catenin，影響下游基因的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡及抑制其轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞]　人參皂苷Rh2；HepG2；Gsk-3β；β-catenin

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.008

·中醫(yī)中藥與免疫·

人參皂苷Rh2通過激活Gsk-3β削弱β-catenin在肝癌HepG2細(xì)胞中的作用①

石慶強(qiáng)左國偉②馮子強(qiáng)③趙綠翠③羅念③游智梅③夏菁③李丹陽③李靜③陳地龍③

(重慶北部新區(qū)第一人民醫(yī)院急診科，重慶401121)

①本文為國家自然科學(xué)基金(31271368)和重慶市教委基金(KJ110308)。

②重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實驗室，重慶400016。

③重慶醫(yī)科大學(xué)，組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，干細(xì)胞與組織工程研究室，重慶400016。

陳地龍(1971年-)，男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥對腫瘤的抑制作用方面的研究，E-mail: chendilong@21cn.com。

[摘要]目的：研究人參皂苷Rh2對HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制。方法：用pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒感染HepG2細(xì)胞，運(yùn)用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化。通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖反應(yīng)。采用FCM檢測細(xì)胞周期及凋亡變化；利用ELISA法檢測細(xì)胞產(chǎn)生Gsk-3β活性；用PCR法檢測細(xì)胞Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表達(dá)；用CHIP法檢測細(xì)胞Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表達(dá)；運(yùn)用Western blot法檢測細(xì)胞Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3蛋白的表達(dá)。結(jié)果：用pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒感染HepG2細(xì)胞，被感染的HepG2細(xì)胞命名為HepG2-β-catenin；CCK-8分析結(jié)果顯示，加藥組給予(10~160 μmol/L)Rh2后HepG2及HepG2-β-catenin細(xì)胞的增殖受到抑制，且Rh2對肝癌HepG2-β-catenin和HepG2細(xì)胞的生長抑制呈劑量和時間依賴。在HepG2細(xì)胞中48、72 h 半數(shù)抑制率分別為100 μmol/L,58.12 μmol/L，在HepG2-β-catenin細(xì)胞中48、72 h半數(shù)抑制率分別是129.2 μmol/L，83.33 μmol/L，故Rh2作用于HepG2-β-catenin細(xì)胞濃度均高于HepG2細(xì)胞,與HepG2細(xì)胞組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。FCM檢測結(jié)果顯示，Rh2可誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，HepG2+ Rh2組G0/G1期(64.57±0.65)，而HepG2-β-catenin+ Rh2組G0/G1期(58.61±2.01)；FCM檢測結(jié)果顯示，Rh2可誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞早期凋亡，HepG2+ Rh2組凋亡率(17.27±2.77)，而HepG2-β-catenin+ Rh2組凋亡率(9.02±1.76)。ELISA結(jié)果顯示，Rh2作用HepG2細(xì)胞12、24、48、72 h后，Gsk-3β的活性隨著作用時間延長，逐漸升高，在48 h最高，隨后其活性開始降低。Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞48 h，與對照組相比，Gsk-3β的活性均增高，而加入Bio后其活性降低，HepG2+ Rh和HepG2-β-catenin+ Rh2組間無明顯差異；PCR、CHIP、WB結(jié)果顯示，人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞后,Gsk-3β、Bax基因及蛋白表達(dá)增加，而β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3基因及蛋白表達(dá)水平下調(diào)。與HepG2-β-catenin+Rh2組相比,HepG2+Rh2組除Gsk-3β外各基因及蛋白的表達(dá)變化更為顯著。結(jié)論：過表達(dá)β-catenin可削弱人參皂苷Rh2對肝癌HepG2細(xì)胞的藥理作用。人參皂苷Rh2通過激活Gsk-3β降解β-catenin，影響下游基因的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡及抑制其轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞]人參皂苷Rh2；HepG2；Gsk-3β；β-catenin

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.008

中圖分類號R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼碼A

文章編號號1000-484X(2015)11-1476-10

作者簡介：石慶強(qiáng)(1986年-)，男，醫(yī)師，主要從事人參對腫瘤的抑制作用方法的研究，同時就職于重慶醫(yī)科大學(xué)，組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，干細(xì)胞與組織工程研究室，E-mail:569770664@qq.com。

通訊作者及指導(dǎo)教師：李靜(1972年-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥對腫瘤的抑制作用方面的研究，E-mail: lijingyangyang@126.com.cn。

[Abstract]Objective:To investigate the inhibitory effect of Rh2 on HepG2 cells and explore the underlying mechanism.Methods: We used lentivirus carrying β-catenin to infect HepG2 cell,and detected expression of β-catenin using fluorescence microscopy.The effect of Rh2 on proliferation of HepG2-β-catenin and HepG2 cells was measured by CKK-8 assay,and flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis.The activity of Gsk-3β was checked by ELISA kit.The expression of Gsk-3β,β-catenin,Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 genes were measured by qRT-PCR.In order to checked the relationship between β-catenin and TCF4,CHIP assay kit was used,the expression of Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 genes were measured by PCR.The expressions of Gsk-3β,β-catenin,Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 proteins were examined by Western blot.Results: HepG2 cells were successfully infected by pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin lentivirus,named HepG2-β-catenin.CCK-8 showed that ginsenoside Rh2 could effectively inhibit the proliferation of HepG2 and HepG2-β-catenin cells in vitro,which exhibits a dose-dependent manner at range of 10-160 μmol/L Rh2.The IC50 of Rh2 exposure on HepG2 cell for 48,72 h were 100 μmol/L and 58.12 μmol/L,but the IC50 of Rh2 exposure on HepG2-β-catenin for 48,72 h were 129.2 μmol/L,83.33 μmol/L,respectively. The IC50 of Rh2 exposure on HepG2-β-catenin cell was higher than HepG2 cell，compared with HepG2 group the differences was statistically significant(P< 0.01).Flow cytometry indicated that Rh2 could arrest HepG2 and HepG2-β-catenin cells in G0/G1 phase；the cell population in G0/G1 phase of HepG2+Rh2 group was(64.57±0.65)%,HepG2-β-catenin+Rh2 group was(58.61±2.01)%.Flow cytometry indicated that Rh2 could induced early apoptosis in HepG2 and HepG2-β-catenin cells.The apoptosis rate of HepG2 + Rh2 group was (17.27 ± 2.77)%,HepG2-β-catenin + Rh2 group(9.02 ± 1.76)%.The ELISA results indicated that HepG2 cells was induced by Rh2 for 12,24,48,72 h,the activity of Gsk-3β gradually increased，peak in 48 h，then decreased.Compared with control group,Rh2 induced HepG2 and HepG2-β-catenin cells for 48 hours,Gsk-3β activity were increased,and their activity reduced after adding Bio,there were no significant differences between HepG2+Rh2 and HepG2-β-catenin+Rh2 groups.The PCR，CHIP and WB results showed that the expression of Gsk-3β,Bax gene and proteins increased,while the β-catenin,CyclinD1,Bcl2,MMP3 gene and proteins down-regulation in HepG2 and HepG2-β-catenin cell induced by Rh2.Compared with HepG2-β-catenin + Rh2 group,the expression of other gene and proteins changed significantly,however,Gsk-3β was no significant difference.Conclusion: Over-expression of β-catenin may weaken the pharmacological effects of ginsenoside Rh2 on HepG2 cells.The activity of Gsk-3β was increased by ginsenoside Rh2 to degrade β-catenin,affecting the expression of downstream genes,promoting apoptosis of liver cancer cells and inhibiting metastasis.

Rh2 weaken effects of β-catenin on HepG2 hepatocellular carcinoma through activating Gsk-3β

SHIQing-Qiang,ZUOGuo-Wei,FENGZi-Qiang,ZHAOLü-Cui,LUONian,YOUZhi-Mei,XIAJing,LIDan-Yang,LIJing,CHENDi-Long.EmergencyDepartmentofFirstPeople′sHospitalofChongqingNewNorthZone，Chongqing401121,China

[Key words]Rh2；HepG2，Gsk-3β；β-catenin

肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，易于肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及向肺、骨、腎、腦轉(zhuǎn)移[1,2]。在中國有十分之一的人攜帶肝炎病毒，肝炎病毒是致癌的高危因素，而肝癌的發(fā)病率正在逐年增加[3,4]。盡管在診斷和治療取得很大進(jìn)步，但肝癌仍是癌癥相關(guān)死亡的全球第三大原因。對廣大肝癌患者來說，手術(shù)切除是最有效的治療方法，但5年生存率<12%[5]。隨著介入治療的發(fā)展，使化療藥物可以直接作用于肝癌細(xì)胞，部分患者的壽命得以延長[6-8]。然而，有的肝癌患者對化療不敏感，容易產(chǎn)生耐藥。對于這部分患者來說，目前缺乏有效的治療方法。因此，尋求有效的藥物來提高治療效果成為研究焦點(diǎn)。

越來越多的研究顯示，治療肝癌時人參成為備選藥物之一，人參的預(yù)防和抗癌作用通過損傷DNA、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖及免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮作用[9-12]。研究證明用人參皂苷Rh2誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞后，可使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并減少S期和G2/M期的細(xì)胞比例。此外，人參皂苷Rh2可下調(diào)正性調(diào)控因子(CyclinD1、CyclinE)的表達(dá)，并上調(diào)負(fù)性調(diào)控因子(P16、P21基因)的表達(dá)[13]。有研究報道，人參皂甙Rh2可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞的凋亡。

Wnt信號通路的異常激活同多種惡性腫瘤如結(jié)、直腸癌，肝癌，乳腺癌，前列腺癌等發(fā)生發(fā)展有關(guān)[14]。β-catenin作為Wnt通路中重要的信號傳遞因子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，同時，β-catenin對抗癌藥物有抵抗作用。β-catenin在正常組織及癌組織中，其穩(wěn)定性依賴于由Axin、APC 和 GSK-3β構(gòu)成的降解復(fù)合物，主要由GSK-3β調(diào)節(jié)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。在無Wnt刺激下，GSK-3β作用于Axin、APC和β-catenin蛋白組成的復(fù)合物并磷酸化β-catenin，被磷酸化的β-catenin可以蛋白酶體的方式迅速降解[15]；在Wnt的刺激下，GSK-3β向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移并與Dishevelled和LRP-5受體結(jié)合從而阻止GSK3β對β-catenin的磷酸化，其結(jié)果是β-catenin逃脫了蛋白酶體的降解，從而在胞漿累積并向胞核移位。聚集在核內(nèi)的β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子如LEF/TCF相互作用，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1、c-jun/fra-1、uPAR、PPARδ、MMP-3、WISP等[16]。上述基因的激活會導(dǎo)致細(xì)胞增殖加速和向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力增強(qiáng)，故GSK-3β可作為一個潛在的抗癌靶點(diǎn)。

糖原合酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3，GSK-3)是一種廣泛表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在1970年被發(fā)現(xiàn)，是參與糖原代謝的關(guān)鍵酶。GSK-3由 433個氨基酸殘基組成，在哺乳動物體內(nèi)含有GSK-3α和 GSK-3β兩種亞型，二者有類似的立體結(jié)構(gòu)和底物，但其功能有所不同，其廣泛存在于各種細(xì)胞中，除了其在糖原代謝中的作用，GSK-3β作為一個下游調(diào)節(jié)開關(guān)，參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、腫瘤形成等多方面發(fā)揮重要作用[17]。Tsuchiya等[18]在結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，GSK-3β可通過降解β-catenin來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長。此外，在實體腫瘤的化療時，影響化療藥物的敏感性和耐藥性與GSK-3β活性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中GSK-3β蛋白的表達(dá)水平顯著低于正常肝組織及癌旁組織，而且低表達(dá)的GSK-3β臨床病理特征預(yù)示著預(yù)后不良[19]。我們實驗室研究發(fā)現(xiàn)，TSPG和Rh2可抑制KG1α細(xì)胞增殖而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，經(jīng)TSPG和Rh2作用后，KG1α細(xì)胞胞核中的β-catenin蛋白明顯減少，其表達(dá)區(qū)域由胞核向胞膜轉(zhuǎn)移。在肝癌細(xì)胞中Rh2是否有類似的作用？而過表達(dá)β-catenin是否可以削弱Rh2這一藥理作用呢？Rh2使KG1α細(xì)胞胞核中的β-catenin蛋白減少，這與GSK-3β是否有關(guān)？

因此，我們假設(shè)Rh2抗癌的作用可能是激活了GSK-3β的活性從而降解β-catenin。我們首先檢測Rh2對HepG2細(xì)胞的藥理作用，然后構(gòu)建了過表達(dá)β-catenin的慢病毒質(zhì)粒感染HepG2細(xì)胞，檢驗過表達(dá)β-catenin能否削弱Rh2對HepG2細(xì)胞的藥理作用；再用GSK-3β抑制劑Bio[(2′Z,3′E)-6-Bromoindirubin-3′-oxime，糖原合酶激酶-3β抑制劑]來驗證Rh2是否激活了GSK-3β；用PCR、CHIP、WB檢測β-catenin下游基因的變化，進(jìn)一步證實Rh2對HepG2細(xì)胞的藥理作用可能是通過激活了GSK-3β的活性從而降解β-catenin來實現(xiàn)的。

1材料與方法

1.1材料人參皂苷 Rh2 購于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng),純度99%；Bio購于Sigma,人肝癌細(xì)胞 HepG2株，由左國偉教授提供，pLOV-EF1a-MCS-3FLAG質(zhì)粒(re-expression β-catenin慢病毒質(zhì)粒及空質(zhì)粒)及293T慢病毒包裝細(xì)胞由上海紐恩生物科技公司提供，DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶、嘌呤酶素購于HyClone；DMSO購于Merk；96孔板購于BIOFIL；Annexin V-FTIC/PI雙染細(xì)胞周期凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物公司；流式細(xì)胞儀購于Becton-Dick；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、BeyoECL Puls(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)購于Sigma，0.45 μm PDVF膜購于Millipore公司；CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒購于DOJINDO研究所，染色質(zhì)共沉淀試劑盒購于Cell Signaling Technology；PCR儀器購于美國Bio-Rad公司,倒置熒光顯微鏡購于日本Olympus 公司；小鼠抗人β-actin購于北京中杉金橋，兔抗人Gsk-3β、β-catenin、MMP3、TCF購于Cell Signaling Technology；兔抗人Bax、BCL2、CyclinD1購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司；

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞以1×105個/ml 接種于含10%血清的DMEM-F12 培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，48～72 h傳代一次。

1.2.2HepG2細(xì)胞的感染及篩選用CCK8篩選嘌呤霉素工作濃度為0.5 μg/μl。取兩個一次性無菌瓶，分別接種2×105ml-1細(xì)胞。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，其中一瓶中加入β-catenin慢病毒顆粒50 μl及4 mg/ml Polybrene 1 μl，另一瓶繼續(xù)原條件培養(yǎng)。感染24 h后，用倒置熒光顯微鏡觀察感染效果，HepG2-β-catenin感染細(xì)胞呈綠色熒光，棄去培養(yǎng)基，加入含有0.5 μg/μl嘌呤霉素的DMEM-F12 培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定感染的HepG2-β-catenin細(xì)胞。HepG2-β-catenin細(xì)胞接種在含0.5 μg/ml嘌呤霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，48～72 h傳代一次。

1.2.3CCK-8法檢測細(xì)胞增殖分別取生長良好的HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞以1 ×104每孔的密度接種于96孔板中，分成對照組和藥物組。藥物組加入不同濃度(10~160 μmol/L)人參皂苷Rh2，對照組加入含0.1% DMSO的DMEM-F12完全培養(yǎng)液，每孔200 μl，每藥物濃度組設(shè)6個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μl CCK-8液體，37℃恒溫孵育3 h，用酶標(biāo)儀測光吸收度值，以對照組作為100%，計算各組抑制率，抑制率(IR%)=[1-藥物組(A)]/對照組(A)×100%，實驗重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分別取對數(shù)生長期的HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，分為對照組與藥物組及抑制劑組，藥物組加入人參皂苷Rh2(100 μmol/L)，抑制劑組加入人參皂苷Rh2(100 μmol/L)+ Bio(10 μmol/L)，以每孔3 ml的培養(yǎng)體系接種于6孔板，每組平行接種3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，用PBS液洗滌2次后，700 ml/L冰乙醇固定，4℃保存。流式細(xì)胞儀檢測，經(jīng)計算機(jī)處理分析得出細(xì)胞周期各時相比例。

1.2.5流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率分別取對數(shù)生長期的HepG2和 HepG2-β-catenin細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，分為對照組與藥物組及抑制劑組，藥物組加入人參皂苷Rh2(100 μmol/L)，抑制劑組加入人參皂苷Rh2(100 μmol/L)+Bio(10 μmol/L)，以每孔3 ml的培養(yǎng)體系接種于6孔板，每組平行接種3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測，計算機(jī)處理分析結(jié)果。

1.2.6ELISA法檢測細(xì)胞Gsk-3β活性將取對數(shù)生長期的HepG2、HepG2-β-catenin細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，分為對照組與藥物組及抑制劑組，藥物組加入人參皂苷Rh2(100 μmol/L)，抑制劑組加入人參皂苷Rh2(100 μmol/L)+Bio(10 μmol/L)，作用48 h，收集各組細(xì)胞并提取蛋白，提取步驟依照說明書操作。在96孔酶標(biāo)板上，空白孔中加入樣品稀釋液100 μl，余孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μl，把樣品加于酶標(biāo)板孔底部，輕輕振蕩，混勻，用覆膜蓋上酶標(biāo)板，放入37℃恒溫箱中120 min。移去液體，用力甩干。取100 μl生物素標(biāo)記抗體工作液加入上述各孔，放入37℃恒溫箱中60 min。用力甩去孔內(nèi)液體，每孔加入PBS 溶液350 μl，浸泡2 min，洗3次，用力甩干，每孔加入100 μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，放入37℃恒溫箱中60 min后，去除孔內(nèi)液體，用力甩干，每孔加入PBS 溶液350 μl，浸泡2 min，洗5次，用力甩干。依次每孔加入90 μl底物溶液，在37℃條件下，避光顯色30 min，每孔加入50 μl終止溶液，終止反應(yīng)，測量各孔的光密度(OD值)。

1.2.7PCR法測HepG2、 HepG2-β-catenin細(xì)胞中Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表達(dá)實驗分為6組：HepG2-β-catenin、HepG2-β-catenin+Rh2、HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio、HepG2、Rh2、Rh2+Bio。收集各處理組細(xì)胞，提取總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成功后進(jìn)行定量分析。β-actin:Forward：5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′；Reverse：5′-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3′。β-catenin：Forwa-rd:5′-CGCCAGGGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-GAC-3′；Reverse-5′-TAATACGACTCACTAGAGGG-3′。 Gsk-3β：Forward：5′-GGATTCGTCAGGAACAGGACA-3′；Reverse：5′-TTAGCATCTGACGCTGCTGT-3′。 Bcl2：Forward：5′-GGTGAACTGGGGGAGGATTG-3′；Rev erse：5′-GGCAGGCATGTTGACTTCAC-3′。 CyclinD1：Forward：5′-CATGGAGAGACAGACAGAGCA-3′；Re verse：5′-TATCCACGGGGCTGTTCCTA-3′。 Bax：Forw ard:5′-TTCATCCAGGATCGAGCAGG-3′；Reverse：5′-CTTGGTGGACGCATCCTGAG-3′。 MMP3:Forward:5′-TAATGGAGATGCCCACTTTGATG-3′；Reverse：5′-GAGTGAAAGAGACCCAGGGAGTG-3′。

1.2.8CHIP-PCR法檢測HepG2、 HepG2-β-catenin細(xì)胞中Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表達(dá)實驗分為6組：HepG2-β-catenin、HepG2-β-catenin+ Rh2、HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio、HepG2、Rh2、Rh2+Bio。在含有9ml培養(yǎng)基的各組細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(75 cm2)分別加入243 μl 37%甲醛，使甲醛終濃度為1%，放入37℃恒溫箱中孵育10 min。終止交聯(lián)：在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入450 μl 2.5 mol/L甘氨酸，調(diào)整甘氨酸至終濃度為0.125 mol/L，輕輕搖晃，室溫放置5 min。倒掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，用力使用細(xì)胞刮刀刮瓶底，并加入8 ml PBS，用移液管移入15 ml離心管中，2 000 r/min 5 min，離心，收集細(xì)胞。棄去上清，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，加入 400 μl SDS Lysis Buffer。調(diào)整細(xì)胞終濃度為每100 μl含1×106個細(xì)胞，再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。超聲破碎：VCX750，25%功率，4.5 s沖擊，10 s間隙，共12次。除雜及抗體哺育：超聲破碎結(jié)束后，1 000 r/min 4℃離心，10 min，去除不溶物質(zhì)。取3個EP管，分別加入100 μl上清液，實驗組加入抗體，對照組不加抗體，電泳組則加入4 μl 5 mol/L NaCl，65℃恒溫箱中孵育3 h解交聯(lián)，在SDS凝膠上電泳，檢驗超聲破碎的效果。在實驗組和對照組中分別加入900 μl CHIP Dilution Buffer和20 μl 50×PIC。再次加入60 μl Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃，慢速顛轉(zhuǎn)1 h。4℃，靜置10 min，700 r/min離心1 min，取上清。各留取20 μl作為input。實驗組加入1 μl 抗體，對照組則不加抗體，在4℃條件下顛轉(zhuǎn)過夜。洗沉淀復(fù)合物和解交聯(lián)：免疫復(fù)合物的沉淀及清洗，孵育過夜后，每管加入60 μl Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。在4℃條件下顛轉(zhuǎn)2 h。4℃，靜置10 min后，700 r/min離心1 min。除去上清。依次用下列溶液(①low salt wash buffer--one wash，②high salt wash buffer--one wash，③LiCl wash buffer--one wash，④TE buffer--two wash )清洗沉淀復(fù)合物。加入溶液，4℃，顛轉(zhuǎn)10 min，4℃，靜置10 min，700 r/min離心1 min，棄去上清。清洗完畢后，每管加入洗脫液(10%SDS，1 mol/L NaHCO3， ddH2O)250 μl，室溫下顛轉(zhuǎn)15 min，靜置離心，收集上清。重復(fù)洗滌一次。每管洗脫液為500 μl。解交聯(lián)：每管中加入20 μl 5 mol/L NaCl(NaCl終濃度為0.2 mol/L)。吹打混勻，65℃解交聯(lián)過夜。DNA樣品的回收：解交聯(lián)結(jié)束后，實驗組和對照組加入1 μl RNaseA(MBI)，37℃恒溫孵育1 h。 實驗組和對照組加入10 μl 0.5 mol/L EDTA， 20 μl 1 mol/L Tris.HCl(pH6.5)，2 μl 10 mg/ml蛋白酶K，45℃處理2 h。采用omega膠回收試劑盒回收DNA片段，加入100 μl ddH2O離心，收集樣品。PCR分析：操作步驟詳見上述PCR的操作。

1.2.9Western blot法檢測HepG2、HepG2-β-catenin細(xì)胞Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3蛋白的表達(dá)將取對數(shù)生長期的HepG2、HepG2-β-catenin細(xì)胞接種于培養(yǎng)基，分為對照組與藥物組及抑制劑組，對照組常規(guī)培養(yǎng)，藥物組加入人參皂苷Rh2(100 μmol/L)，抑制劑組人參皂苷Rh2(100 μmol/L)+Bio(10 μmol/L)，孵育48 h，收集各組細(xì)胞，提取蛋白。提取步驟按照說明書進(jìn)行操作。測蛋白濃度，并使蛋白變性。配制膠體，電泳，電轉(zhuǎn)，結(jié)束后，將膜取出并放在5%牛奶封閉液中室溫封閉1.5 h；4℃下與兔抗人抗體Gsk-3β(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、Bcl2(1∶1 000)、CyclinD1、Bax(1∶1 000)、MMP3(1∶500)，鼠抗人β-actin(1∶1 000)孵育過夜；用TBST溶液漂洗后分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)，常溫孵育1.5 h，再次用TBST漂洗，加入顯色劑ECL試劑顯色去曝光。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1獲得HepG2-β-catenin細(xì)胞用pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒感染HepG2細(xì)胞，感染成功的HepG2細(xì)胞命名為HepG2-β-catenin，通過熒光顯微鏡觀察，細(xì)胞中可見大量綠色熒光；而HepG2細(xì)胞中無熒光(圖1)。用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，感染第2天細(xì)胞的感染率為94.08%,第3天感染率為99.49%(圖2)。用PCR檢測HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞β-catenin基因的表達(dá)，與HepG2組相比，隨著感染后時間延長，HepG2-β-catenin細(xì)胞β-catenin基因表達(dá)明顯高于HepG2組，與HepG2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖3)。

2.2Rh2對HepG2 和HepG2-β-catenin細(xì)胞增殖的抑制作用采用CCK-8法檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞體外生長活躍，經(jīng)Rh2(10~160 μmol/L)處理，HepG2細(xì)胞增殖受到抑制，計算48、72 h 半數(shù)抑制率分別為100 μmol/L、58.12 μmol/L，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且Rh2對肝癌HepG2細(xì)胞的生長抑制作用呈劑量和時間依賴。同時，我們也檢測了Rh2對HepG2-β-catenin細(xì)胞增殖的影響，經(jīng)Rh2作用48、72 h，對HepG2-β-catenin細(xì)胞的48、72 h 半數(shù)抑制率分別是129.2 μmol/L，83.33 μmol/L，Rh2作用于HepG2-β-catenin細(xì)胞的濃度均高于HepG2細(xì)胞，與HepG2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4、5。

圖1　熒光顯微鏡觀察HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞β-catenin基因轉(zhuǎn)染狀況Fig.1　HepG2 and HepG2-β-catenin were observed by fluorescence microscopyNote: A0.HepG2-β-catenin；B0.HepG2.

圖2　流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞感染率Fig.2　Rate of infection was analyzed by flow cytometryNote: B0.HepG2 cells；A0+2 day.HepG2-β-catenin cells+2 day；A0+3 day.HepG2-β-catenin +3 day.

圖3　用PCR方法檢測細(xì)胞β-catenin的表達(dá)Fig.3　Expression of β-catenin gene in HepG2 and HepG2-β-catenin were measured by qRT-PCRNote: B0.HepG2 cells；A0+2 day.HepG2-β-catenin cells+2 day；A0+3 day.HepG2-β-catenin +3 day.*.P<0.01.

圖4　Rh2對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.4　Inhibitory effect of Rh2 on HepG2 cellsNote: HepG2 cells were incubated with Rh2 for 24,48,72 h and then assessed by the CKK assay.

圖5　Rh2對HepG2-β-catenin細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.5　Inhibitory effect of Rh2 on HepG2 cellsNote: HepG2-β-catenin cells were incubated with Rh2 for 24,48,72 h and then assessed by the CKK assay.

圖6　Rh2對HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞周期的影響Fig.6　Effect of Rh2 on HepG2 and HepG2-β-catenin cells cycleNote: HepG2-β-catenin and HepG2 cells was induced for 24 h with Rh2 or Rh2+Bio.Cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry;A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2 A2；HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio;B0.HepG2；B1.HepG2+ Rh2；B2.HepG2+ Rh2+Bio.

2.3Rh2對HepG2 和HepG2-β-catenin細(xì)胞周期的影響Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期；HepG2組G0/G1期(61.02±1.48)%，HepG2+Rh2組(64.57±0.65)%，HepG2-β-catenin組(52.86±1.46)%，HepG2-β-catenin+Rh2組(58.61±2.01)%。與HepG2組相比，HepG2-β-catenin組細(xì)胞的G0/G1期(52.86+1.46)%明顯低于HepG2組(61.02+1.48)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1、圖6。

表1　100 μmol/L Rh2對HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞周期的影響(±s，n=3)Tab.1　Effect of Rh2 cell cycle of HepG2 and HepG2-β-catenin cells(±s，n=3)

表1　100 μmol/L Rh2對HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞周期的影響(±s，n=3)Tab.1　Effect of Rh2 cell cycle of HepG2 and HepG2-β-catenin cells(±s，n=3)

GroupG0/G1G2/MSHepG2-β-catenin52.86±1.469.10±0.97638.03±1.84HepG2-β-catenin+Rh258.61±2.011)10.54±0.4731)30.85±2.081)HepG2-β-catenin+Rh2+Bio54.43±1.551)12.96±3.031)32.60±2.291)HepG261.02±1.482)8.12±1.0230.84±2.512)HepG2+Rh264.57±0.653)4)10.74±0.793)29.12±2.153)HepG2+Rh2+Bio60.13±3.19▽10.73±1.073)29.12±2.153)

Note：1)P<0.01 HepG2-β-catenin+ Rh2,HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio vs HepG2-β-catenin group;2)P<0.01 HepG2 vs HepG2-β-catenin;3)P<0.01HepG2+ Rh2,HepG2+ Rh2+Bio vs HepG2;4)P<0.01 HepG2+ Rh2 vs HepG2-β-catenin+ Rh2.

2.4Rh2對HepG2 和HepG2-β-catenin細(xì)胞的早期凋亡作用Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞早期凋亡。HepG2組細(xì)胞凋亡率(10.01±2.02)%，HepG2+Rh2組細(xì)胞凋亡率(17.27±2.77)%，HepG2-β-catenin組細(xì)胞凋亡率(5.26±0.50)%，HepG2-β-catenin+ Rh2組細(xì)胞凋亡率(9.02±1.76)%，HepG2-β-catenin+Rh2組細(xì)胞凋亡率低于HepG2+Rh2組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2、圖7。

2.5Rh2可激活細(xì)胞Gsk-3β的活性Rh2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞12、24、48、72 h后，Gsk-3β活性逐漸升高，在48 h最高，隨后其活性降低。與對照組相比，Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞48 h，Gsk-3β的活性均增高，而加入Bio后其活性降低。與Rh2組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而HepG2+ Rh2和HepG2-β-catenin+ Rh2組之間無差異，見圖8、9。

表2　Rh2對HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞早期凋亡的影響(±s，n=3)Tab.2　Effect of Rh2 on cell apoptosis of HepG2 and HepG2-β-catenin cells(±s，n=3)

表2　Rh2對HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞早期凋亡的影響(±s，n=3)Tab.2　Effect of Rh2 on cell apoptosis of HepG2 and HepG2-β-catenin cells(±s，n=3)

GroupsApoptosisrate(%)HepG2-β-catenin5.26±0.50HepG2-β-catenin+Rh29.02±1.761)HepG2-β-catenin+Rh2+Bio7.02±1.211)HepG210.01±2.022)HepG2+Rh217.27±2.773)4)HepG2+Rh2+Bio12.12±0.1753)

Note：1)P<0.01 HepG2-β-catenin+ Rh2,HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio vs HepG2-β-catenin group;2)P<0.01 HepG2 vs HepG2-β-catenin;3)P<0.01 HepG2+ Rh2,HepG2+ Rh2+Bio vs HepG2;4)P<0.01 HepG2+ Rh2 vs HepG2-β-catenin+ Rh2.

圖7　Rh2 對HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞凋亡的影響Fig.7　Effect of Rh2 on HepG2 and HepG2-β-catenin cells apoptosisNote: HepG2-β-catenin and HepG2 cells was induced for 24 h with Rh2 or Rh2+Bio.Cell cycle distribution was analyzed by Annexin V-FTIC/PI.C0.HepG2-β-catenin；C1.HepG2-β-catenin+ Rh2；C2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio;D0.HepG2；D1： HepG2+ Rh2；D2.HepG2+ Rh2+Bio.

2.6Rh2對HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞Gsk-3β、Bax、β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3基因表達(dá)的影響Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞后,Gsk-3β、Bax基因的表達(dá)增加，而β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3基因表達(dá)下調(diào)。與HepG2-β-catenin+Rh2組相比,HepG2+Rh2組中Bax基因表達(dá)增加更為顯著；而β-catenin、Bcl2、CyclinD1、MMP3基因表則降低明顯，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖10。

2.7Rh2對HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞Bax、CyclinD1、Bcl2、MMP3基因表達(dá)的影響Rh2與HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞共培養(yǎng)后，超聲破碎細(xì)胞，提出DNA，電泳驗證，其分子量在100~500 bp，TCF4抗體結(jié)合DNA后用半定量PCR檢測。HepG2+Rh2組和HepG2-β-catenin+Rh2組細(xì)胞中Bax基因表達(dá)增加，而CyclinD1、Bcl2、MMP3基因表達(dá)下調(diào)；與HepG2-β-catenin+Rh2相比,HepG+Rh2組中Bax基因表達(dá)增加更明顯；而Bcl2、CyclinD1、MMP3基因表達(dá)降低更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖11、12。

圖8　ELISA檢測HepG2細(xì)胞中Gsk-3β的活性Fig.8　Activity of Gsk-3β was checked by ELISA kitNote: In treat group,the activity of GSK-3β increased with time-depend manner.*.P<0.01.

圖9　ELISA檢測HepG2-β-catenin 和HepG2細(xì)胞中Gsk-3β的活性Fig.9　Activity of Gsk-3β in HepG2-β-catenin and HepG2 was checked by ELISA kitNote: A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2；A2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio；B0.HepG2；B1. HepG2+Rh2；B2.HepG2+ Rh2+Bio.*.P<0.01 HepG2-β-catenin+Rh2,HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio vs HepG2-β-catenin group;#.P<0.01，HepG2+ Rh2,HepG2+ Rh2+Bio vs HepG2.

2.8Rh2對HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞Gsk-3β、Bax、β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3蛋白表達(dá)的影響Rh2誘導(dǎo)后,HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞Gsk-3β、Bax蛋白表達(dá)增加，而β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3蛋白表達(dá)下調(diào)。與HepG2-β-catenin+Rh2組相比， HepG+Rh2組細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)量大于HepG2-β-catenin +Rh2組；而β-catenin、Bcl2、CyclinD1、MMP3蛋白表達(dá)低于HepG2-β-catenin+Rh2組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖13。

圖10　PCR檢測HepG2-β-catenin 和HepG2細(xì)胞中Gsk-3β、β-catenin Bax、Bcl2、CyclinD1、MMP3基因的表達(dá)Fig.10　Expression of Gsk-3β,β-catenin,Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 genes were measured by qRT-PCRNote: A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2；A2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio；B0.HepG2；B1.HepG2+ Rh2；B2.HepG2+Rh2+Bio.*.P<0.01 HepG2-β-catenin+ Rh2,HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio vs HepG2-β-catenin group;△.P<0.01 HepG2 vs HepG2-β-catenin;▽.P<0.01HepG2+ Rh2,HepG2+ Rh2+Bio vs HepG2;#.P<0.01 HepG2+ Rh2 vs HepG2-β-catenin+ Rh2.

圖11　電泳檢查超聲破碎的DNAFig.11　DNA electrophoresis figureNote: A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2；A2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio；B0.HepG2；B1.HepG2+ Rh2；B2.HepG2+ Rh2+Bio.

3討論

人參作為傳統(tǒng)中草藥廣泛應(yīng)用于中醫(yī)治療中，近年來其有效成分用于各種腫瘤的預(yù)防與治療[9,13]。大量研究表明，人參皂甙Rh2可顯著影響并誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞凋亡[12,20-22]。我們的實驗研究也發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rh2可抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖，且呈濃度和時間依賴性。48、72 h的Rh2 IC50 分別為100 μmol/L，58.12 μmol/L。我們實驗室研究發(fā)現(xiàn)，TSPG可抑制KG1α細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該作用機(jī)制可能與其抑制β-catenin蛋白及mRNA表達(dá)水平有關(guān)。臨床研究表明，細(xì)胞過表達(dá)β-catenin對化療或放療有抵制作用，且預(yù)后差[18]。我們用過表達(dá)β-catenin的慢病毒感染HepG2肝癌細(xì)胞，獲取HepG2-β-catenin細(xì)胞，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rh2對HepG2-β-catenin細(xì)胞的增殖抑制也呈濃度和時間依賴性，但所需Rh2的濃度明顯高于HepG2細(xì)胞，作用48、72 h的 Rh2 IC50分別是129.2 μmol/L、83.33 μmol/L。其結(jié)果顯示，過表達(dá)β-catenin會削弱Rh2對HepG2肝癌細(xì)胞的藥理作用。

圖12　用半定量PCR檢測Bax、Bcl2、CyclinD1、MMP3基因的表達(dá)Fig.12　Expression of Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 genes were measured by PCRNote: A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2；A2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio.B0.HepG2；B1.HepG2+ Rh2；B2.HepG2+ Rh2+Bio.

圖13　Western blot檢測HepG2-β-catenin 和HepG2細(xì)胞中Gsk-3β、β-catenin Bax、Bcl2、CyclinD1、MMP3蛋白的表達(dá)Fig.13　Expression of Gsk-3β,β-catenin,Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 protein were measured by Western blotNote: A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2；A2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio；B0.HepG2；B1.HepG2+ Rh2；B2.HepG2+ Rh2+Bio.*.P<0.01 HepG2-β-catenin+ Rh2,HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio vs HepG2-β-catenin group;△.P<0.01 HepG2 vs HepG2-β-catenin;▽.P<0.01 HepG2+ Rh2,HepG2+ Rh2+Bio vs HepG2;#.P<0.01 HepG2+ Rh2 vs HepG2-β-catenin+ Rh2.

先前的研究結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin信號通路持續(xù)激活可促進(jìn)結(jié)腸、胰腺組織腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的形成[14,23]。為了探索Rh2及過表達(dá)β-catenin對HepG2肝癌細(xì)胞周期和凋亡的影響，我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，與HepG2組細(xì)胞相比，HepG2-β-catenin組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例(52.86±1.46)%明顯低于HepG2組(61.02±1.48)%，說明過表達(dá)β-catenin可對細(xì)胞周期產(chǎn)生影響，G0/G1期細(xì)胞比例的減少，可加速細(xì)胞的增殖。結(jié)果提示，Rh2對HepG2和HepG2-β-catenin的抗癌作用是使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。同時，Rh2作用HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞后，CyclinD1基因和蛋白表達(dá)水平均降低。CyclinD1作為腫瘤惡性增殖關(guān)鍵因子，其表達(dá)水平下調(diào)可使腫瘤細(xì)胞增殖失控得到抑制。HepG2+Rh2組細(xì)胞中CyclinD1基因和蛋白表達(dá)水平明顯低于HepG2-β-catenin+Rh2組，說明過表達(dá)β-catenin可削弱Rh2下調(diào)CyclinD1基因和蛋白表達(dá)的作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，Rh2作用后，HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞凋亡率均增高，但HepG2-β-catenin+Rh2組細(xì)胞凋亡率低于HepG2+Rh2組。上述實驗結(jié)果表明，過表達(dá)β-catenins可削弱Rh2對HepG2肝癌細(xì)胞生存抑制作用和降低凋亡率。

GSK-3β的異常磷酸化及失活參與肝癌的形成。本文用酶免疫吸附試驗檢測結(jié)果顯示，Rh2均能以時間與濃度依賴方式激活HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞GSK-3β活性，且兩組之間無明顯差異。又采用GSK-3β抑制劑Bio拮抗Rh2的作用，來驗證Rh2是否激活了GSK-3β。在HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞同時加入Rh2和Bio后，GSK-3β活性均有所降低，但仍然明顯高于HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞組，這證明Rh2可以激活GSK-3β，且此過程可以被Bio所拮抗。用PCR和Western blot法檢測了Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞48 h后，GSK-3β基因和蛋白表達(dá)水平均增高，且兩種細(xì)胞之間無統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果說明，Rh2既激活GSK-3β的活性又能夠使其表達(dá)增強(qiáng)。

β-catenin在正常組織及癌組織中作為一個重要的分子，它的穩(wěn)定性依賴于由Axin、APC 和 GSK-3β構(gòu)成的降解復(fù)合物，主要由GSK-3β去調(diào)節(jié)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。Rh2誘導(dǎo)HepG2和HepG2-β-catenin細(xì)胞48 h后，GSK-3β活性增加。用PCR和Western blot檢測結(jié)果表明，與HepG2組細(xì)胞相比，HepG2+ Rh2組細(xì)胞中β-catenin基因和蛋白表達(dá)水平明顯下降。同時檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HepG2-β-catenin組相比，HepG2-β-catenin+ Rh2組中β-catenin基因和蛋白水平有所下降，但下降幅度沒有HepG2+ Rh2組明顯。該結(jié)果表明，過表達(dá)β-catenin能削弱Rh2對β-catenin的降解作用，進(jìn)一步證實Rh2降解β-catenin是通過激活GSK-3β的活性。

在無Wnt刺激下，GSK-3β作用于Axin、APC和β-catenin蛋白組成的復(fù)合物并磷酸化β-catenin，被磷酸化的β-catenin可以蛋白酶體的方式迅速降解[15]；在Wnt的刺激下，GSK-3β向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移并與Dishevelled和LRP-5受體結(jié)合，從而阻止GSK3β對β-catenin的磷酸化，其結(jié)果是β-catenin逃脫了蛋白酶體的降解，因此在胞漿累積并向胞核移位。本文采用PCR檢測結(jié)果顯示，與HepG2組細(xì)胞相比，HepG2+ Rh2組中CyclinD1、Bcl2、MMP3表達(dá)減少，而Bax增加。前面的實驗結(jié)果顯示，Rh2誘導(dǎo)HepG2后β-catenin表達(dá)量明顯下降，為了進(jìn)一步探討β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核數(shù)量減少對下游基因的影響，我們采用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法檢測下游基因[24]。結(jié)果顯示，Rh2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞48 h后，在HepG2+ Rh2中CyclinD1、Bcl2、MMP3表達(dá)減少，而Bax表達(dá)增加，Western blot檢測結(jié)果與染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果一致。同時檢測結(jié)果顯示，HepG2-β-catenin+Rh2組細(xì)胞中Bax基因和蛋白表達(dá)增加程度與Bcl2、CyclinD1、MMP3基因和蛋白表達(dá)減少程度均明顯弱于HepG2+Rh2組。該結(jié)果表明，Rh2可通過激活GSK-3β活性降解β-catenin，使進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin減少，進(jìn)而抑制周期、增殖及遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，最終抑制HepG2細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡；而過表達(dá)β-catenin能削弱Rh2對HepG2細(xì)胞的促凋亡作用。

Rh2抗腫瘤的作用顯著，但它能否抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移尚未被證實。β-catenin是黏附分子，有關(guān)β-catenin在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用報道很少。Miyazawa等[26]人發(fā)現(xiàn)，在浸潤性腫瘤組織中可以出現(xiàn) β-catenin細(xì)胞核表達(dá)。MMP3 是降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要蛋白水解酶，主要的作用底物是Ⅳ型膠原，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，從而參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程。本實驗Western blot和PCR檢測結(jié)果顯示，Rh2能夠抑制HepG2細(xì)胞β-catenin和MMP3蛋白及基因的表達(dá)，結(jié)果還提示Rh2可能具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

綜上所述，過表達(dá)β-catenin可削弱Rh2對肝癌HepG2細(xì)胞的藥理作用。Rh2通過激活Gsk-3β降解β-catenin，影響下游基因的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡及抑制其轉(zhuǎn)移。

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[收稿2015-06-06修回2015-07-20]

(編輯倪鵬)