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EAE小鼠胸腺萎縮與疾病嚴重程度關(guān)系的初步探究①

2016-01-31 01:09:19魏高輝鄭配國張俊華馬雪涵孟憲春劉紅春
中國免疫學雜志 2015年11期
關(guān)鍵詞:后肢高峰期胸腺

魏高輝 鄭配國 張俊華 馬雪涵 孟憲春 明 亮 劉紅春

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科,河南省檢驗醫(yī)學重點實驗室,鄭州450052)

[摘 要] 目的:研究EAE小鼠胸腺萎縮與疾病嚴重程度的關(guān)系。方法:MOG35-55肽免疫C57BL/6小鼠誘導(dǎo)EAE,分析EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮的關(guān)系,流式細胞分析胸腺CD4+CD8+雙陽性細胞、CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞與疾病嚴重程度的關(guān)系。 結(jié)果:尾部無力小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(20.25±3.49)×106個,雙后肢無力小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(4.93±0.85)×106個,雙后肢癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(1.8±0.19)×106個,四肢完全癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(0.52±0.07)×106個,組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);EAE疾病越重,CD4+CD8+雙陽性細胞在胸腺細胞中的比例越低,CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例越高,不同疾病組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論:EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮程度關(guān)系密切,EAE小鼠中活化T細胞的定向遷移可能導(dǎo)致胸腺萎縮。

[關(guān)鍵詞] 實驗性自身免疫性腦脊髓炎;胸腺;萎縮

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.003

EAE小鼠胸腺萎縮與疾病嚴重程度關(guān)系的初步探究①

魏高輝鄭配國張俊華馬雪涵孟憲春明亮②劉紅春②

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科,河南省檢驗醫(yī)學重點實驗室,鄭州450052)

[摘要]目的:研究EAE小鼠胸腺萎縮與疾病嚴重程度的關(guān)系。方法:MOG35-55肽免疫C57BL/6小鼠誘導(dǎo)EAE,分析EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮的關(guān)系,流式細胞分析胸腺CD4+CD8+雙陽性細胞、CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞與疾病嚴重程度的關(guān)系。 結(jié)果:尾部無力小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(20.25±3.49)×106個,雙后肢無力小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(4.93±0.85)×106個,雙后肢癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(1.8±0.19)×106個,四肢完全癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(0.52±0.07)×106個,組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);EAE疾病越重,CD4+CD8+雙陽性細胞在胸腺細胞中的比例越低,CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例越高,不同疾病組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論:EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮程度關(guān)系密切,EAE小鼠中活化T細胞的定向遷移可能導(dǎo)致胸腺萎縮。

[關(guān)鍵詞]實驗性自身免疫性腦脊髓炎;胸腺;萎縮

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.003

中圖分類號①本文為國家自然科學基金項目(81172835)。

通訊作者②,E-mail:xingyunerliu@163.com;E-mail:jykmingliang@163.com。

作者簡介:魏高輝(1989年-),男,主要從事自身免疫病機制方面的研究,E-mail:wghyxjy@163.com。

[Abstract]Objective:To study the relationship between atrophy of the thymus and disease severity in EAE.Methods: MOG35-55 peptide induced EAE in C57BL/6 mice and analyzed the relationship between the severity of EAE and thymic atrophy,F(xiàn)low cytometry analysis was used to evaluate thymic CD4+CD8+DP cells,CD4+CD8-,CD4-CD8+SP cells in relation to the severity of the disease.Results: The number of thymocytes in mice with decreased tail tone was (20.25 ± 3.49)×106,hindlimb weakness(4.93 ± 0.85)×106,complete hindlimb paralysis(1.8 ± 0.19)×106,and forelimb and hindlimb paralysis(0.52 ± 0.07)×106,there were statistically significant differences between groups(P<0.05).As the disease progresses,CD4+CD8+DP cells ratio decreased,CD4+CD8-,CD4-CD8+SP cell ratio increased,different disease groups was statistically significant difference (P<0.05).Conclusion: The atrophy of thymus was closely related to the severity of EAE.Migration of activated T cells in EAE may cause atrophy of thymus.

Preliminary inquiry EAE mouse atrophy of thymus relationship with disease severity

WEIGao-Hui,ZHENGPei-Guo,ZHANGJun-Hua,MAXue-Han,MENGXian-Chun,MINGLiang,LIUHong-Chun.ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,HenanKeyLaboratoryofMedicalLaboratory,Zhengzhou450052,China

[Key words]Experimental autoimmune encephalomyelitis;Thymus;Atrophy

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是自身免疫相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病,自身髓鞘抗原特異性CD4+T細胞與疾病密切相關(guān)[1]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是研究MS的理想動物模型,與MS具有類似的病理特征。Tsunoda等[2]研究發(fā)現(xiàn),EAE小鼠可出現(xiàn)胸腺、脾臟、淋巴結(jié)的嚴重萎縮及大量胸腺淋巴細胞凋亡。胸腺作為中樞免疫器官,是T細胞分化發(fā)育的主要場所。前期研究發(fā)現(xiàn),EAE小鼠發(fā)病高峰期胸腺嚴重萎縮,CD4+CD8+DP細胞減少。為探究EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮的關(guān)系,本研究計數(shù)不同疾病嚴重程度EAE小鼠胸腺淋巴細胞,分析T細胞亞群比例變化,探討胸腺淋巴細胞變化與疾病的關(guān)系,以期闡明胸腺萎縮機制。

1材料與方法

1.1材料C57BL/6小鼠6~8周齡在河南省實驗動物中心SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)。髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein,MOG35-55)由上海吉爾生化公司提供;百日咳毒素 (Pertussis toxin,PT ) 由北京聯(lián)立信生物技術(shù)有限責任公司提供;大鼠抗小鼠抗體(CD4-FITC,CD8-PE)由eBioscience公司提供。

1.2免疫小鼠實驗C57BL/6小鼠49只,隨機抽取45只小鼠誘導(dǎo)EAE,另外4只作為對照。誘導(dǎo)EAE:CFA(含5 mg/ml的滅活的結(jié)核桿菌素)與1.5 mg/ml的MOG溶液等體積混合后徹底乳化,于小鼠雙側(cè)背部皮下免疫(200 μl/只),在免疫后當時和第二天尾靜脈注射PT稀釋液(200 μl/只)。對照組小鼠在雙側(cè)背部皮下注射PBS(200 μl/只),在當天和第二天尾靜脈注射PBS(200 μl/只)。小鼠每天進行臨床評分:0分無臨床癥狀;0.5分尾部無力 ; 1.0分尾部癱瘓 ;1.5分一后肢無力 ; 2.0分兩后肢均無力 ;2.5分一后肢癱瘓另一后肢無力 ;3.0分雙后肢癱瘓 ;3.5分后肢癱瘓及前肢無力 ; 4.0分四肢全部癱瘓 ;5.0分死亡 。

1.3小鼠處理我們誘導(dǎo)的EAE小鼠發(fā)病特點是進展期進展迅速。小鼠處死時間以小鼠發(fā)病階段處于發(fā)病高峰期為準,我們確定EAE小鼠發(fā)病高峰期以臨床評分穩(wěn)定不變3 d,在第3天處死小鼠,即發(fā)病高峰期小鼠。由于小鼠個體差異,發(fā)病時間及進展至高峰期時間不同,處死小鼠的時間依據(jù)上面的標準。EAE小鼠發(fā)病高峰期疾病嚴重程度各有不同,分組依據(jù)以發(fā)病高峰期小鼠臨床評分為準,在后期統(tǒng)計中對所有EAE小鼠進行分析。另外,為驗證緩解期變化,有一部分發(fā)病較重小鼠(臨床評分3.5以上),分成EAE高峰期小鼠組和EAE緩解期小鼠組,EAE高峰期小鼠組在高峰期處死,EAE緩解期小鼠組繼續(xù)記錄觀察小鼠臨床評分,在EAE小鼠進入緩解期臨床評分穩(wěn)定不變第3天處死,取胸腺。

1.4制備脊髓組織切片EAE小鼠在發(fā)病高峰期,在深度麻醉下,用40 g/L的多聚甲醛溶液進行心臟灌注,然后取出脊髓,放入40 g/L的多聚甲醛溶液中固定,切片進行HE染色觀察淋巴細胞浸潤和脫髓鞘現(xiàn)象。

1.5胸腺淋巴細胞分離計數(shù)及流式細胞術(shù)分析實驗組小鼠誘導(dǎo)EAE后,發(fā)病高峰期(依據(jù)見材料與方法1.3)記錄小鼠臨床評分;EAE緩解期小鼠組,在緩解期記錄小鼠臨床評分,頸部脫臼處死小鼠取小鼠胸腺,制成單細胞懸液,用牛鮑計數(shù)板計數(shù)細胞總數(shù);然后計數(shù)1×106個細胞,進行熒光抗體染色,標記CD4-FITC、CD8-PE,30 min,4℃避光孵育,進行流式檢測(BD FACS Calibur)。

2結(jié)果

2.1EAE小鼠模型誘導(dǎo)成功C57BL/6小鼠雙側(cè)背部皮下MOG35-55肽乳化劑免疫,尾靜脈注射PT后,EAE小鼠病程經(jīng)歷進展期,到達發(fā)病高峰期,出現(xiàn)典型的運動系統(tǒng)障礙的癥狀,EAE小鼠發(fā)病高峰期脊髓組織切片HE染色顯示大量炎性細胞浸潤(圖1A、B);以上表明EAE小鼠模型誘導(dǎo)成功。對所有的實驗小鼠進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)EAE誘導(dǎo)發(fā)病率達100%,在后期統(tǒng)計中對所有EAE小鼠進行分析,EAE發(fā)病高峰期小鼠疾病臨床評分分布:0.5分的2只,1.0分的6只,1.5分的2只,2.0分的11只,2.5分的2只,3.0分的14只,3.5分的3只,4.0分的5只,5.0分的無。

2.2EAE小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)與疾病嚴重程度的關(guān)系計數(shù)EAE小鼠發(fā)病高峰期胸腺淋巴細胞,尾部無力小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(20.25±3.49)×106個,雙后肢無力小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(4.93±0.85)×106個,雙后肢癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(1.8±0.19)×106個,四肢完全癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(0.52±0.07)×106個,EAE小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)與疾病嚴重程度關(guān)系密切。隨著EAE小鼠疾病嚴重程度的增加,胸腺淋巴細胞數(shù)量減少,組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

2.3胸腺淋巴細胞亞群與疾病嚴重程度的關(guān)系以EAE小鼠臨床評分分析胸腺淋巴細胞亞群的比例變化。其中臨床評分1.0分的小鼠6只,2.0分的小鼠11只,3.0分的14只,4.0分的2只;流式細胞分析發(fā)現(xiàn),EAE小鼠臨床評分越高,胸腺CD4+CD8+雙陽性細胞比例越低,同時CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例增高(圖3A)。胸腺中CD4+CD8+雙陽性細胞與CD4+CD8-和CD4-CD8+單陽性細胞與EAE小鼠疾病嚴重程度關(guān)系密切,EAE疾病越重,CD4+CD8+雙陽性細胞比例越低,CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例越高(圖3B),組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 EAE小鼠不同臨床評分胸腺淋巴細胞數(shù)比較Fig.2 Comparing different clinical scoring number of thymocytes in EAE mice

圖3 EAE小鼠不同臨床評分及對照組小鼠胸腺細胞流式分析Fig.3 EAE group in different clinical score and control group result of flow cytometry of thymocyte

2.4EAE小鼠胸腺具有可復(fù)性研究EAE小鼠病程周期中胸腺細胞的變化規(guī)律,對發(fā)病高峰期EAE小鼠評分為4.0分的小鼠進行分組:EAE高峰期小鼠組2只和EAE緩解期小鼠組3只;EAE高峰期小鼠組小鼠處死,EAE緩解期小鼠組小鼠繼續(xù)觀察,發(fā)現(xiàn)3只全部進入緩解期,其中1只緩解期評分為2.0分,另外2只評分為1.0;選擇緩解期評分為1.0的小鼠與EAE高峰期小鼠組胸腺淋巴細胞計數(shù)進行比較,小鼠在發(fā)病高峰期胸腺淋巴細胞數(shù)顯著低于緩解期(P<0.01)(圖4);流式細胞分析發(fā)現(xiàn),進入緩解期的EAE小鼠胸腺淋巴細胞中CD4+CD8+雙陽性細胞比例回升,CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例降低,組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 EAE小鼠發(fā)病高峰期和緩解期胸腺淋巴細胞數(shù)變化Fig.4 Change of peak and remission EAE mice thymocyte numberNote:*.P<0.01,one-way ANOVA.

3討論

EAE是一種廣泛使用的作為自身免疫病MS的動物模型[3]。EAE小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘組織病理特點與MS相似。EAE發(fā)病高峰期,胸腺萎縮[2]。作為中樞免疫器官,胸腺維持機體免疫功能正常及免疫細胞發(fā)育成熟。胸腺易萎縮,Hirokawa等[4]發(fā)現(xiàn)胸腺萎縮與年齡關(guān)系密切,C57BL/6小鼠在成年后,隨年齡增長,胸腺重量減輕,體積減小,淋巴細胞減少。營養(yǎng)不良、應(yīng)激、創(chuàng)傷都可導(dǎo)致胸腺萎縮[5]。而T淋巴細胞主要在胸腺中發(fā)育成熟,從來自骨髓的多能干細胞開始,經(jīng)歷DN、DP、SP階段,通過陽性選擇和陰性選擇,無能T淋巴細胞和自身反應(yīng)性T淋巴細胞以凋亡的形式被清除,有5%左右的T淋巴細胞發(fā)育成熟,釋放到外周發(fā)揮免疫功能,這些成熟的T細胞具備免疫反應(yīng)性和自身免疫耐受的特點。

前期研究發(fā)現(xiàn),EAE小鼠胸腺萎縮,細胞凋亡,其中主要凋亡細胞群是CD4+CD8+雙陽性細胞。在EAE中胸腺萎縮細胞凋亡,其與疾病嚴重程度的關(guān)系研究未見報道。我們利用發(fā)病高峰期疾病嚴重程度不同的EAE小鼠,探究胸腺萎縮情況,根據(jù)疾病嚴重程度,分析胸腺中不同淋巴細胞亞群的比例,以期掌握胸腺萎縮與疾病嚴重程度的關(guān)系,為進一步研究EAE發(fā)病機制及自身免疫病胸腺萎縮機制提供參考。

我們的實驗結(jié)果顯示,EAE小鼠中尾部無力小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(20.25±3.49)×106個,雙后肢無力小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(4.93±0.85)×106個,雙后肢癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(1.8±0.19)×106個,四肢完全癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數(shù)為(0.52±0.07)×106個,EAE疾病越重,胸腺淋巴細胞數(shù)量越少。胸腺萎縮與疾病嚴重程度關(guān)系密切;流式分析顯示隨疾病嚴重程度的增加,CD4+CD8+雙陽性細胞比例逐漸降低,CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例逐漸升高,胸腺淋巴細胞亞群比例與疾病嚴重程度關(guān)系密切。Savino等[6]研究發(fā)現(xiàn)急性感染可導(dǎo)致胸腺萎縮,在急性感染免疫中,大量免疫細胞激活,遷移至炎癥部位,導(dǎo)致胸腺萎縮。在EAE發(fā)病高峰期,大量免疫細胞活化,據(jù)此推測可能導(dǎo)致胸腺萎縮的機制與急性感染相似。Yoh等[7]發(fā)現(xiàn)活化的T細胞遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)是導(dǎo)致EAE發(fā)病的主要原因,Martinez等[8]認為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Th1通過轉(zhuǎn)錄因子T-bet,分泌炎性細胞因子如IFN-γ,參與EAE的發(fā)病。又有學者發(fā)現(xiàn)Th17表達RORγt,分泌炎性細胞因子IL-17、IL-21、IL-22和TNF-α,在MS和EAE的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用[9]。上述學者的研究證實大量免疫細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的聚集、活化及細胞因子的分泌,導(dǎo)致EAE的發(fā)生。EAE活躍階段,外周接觸髓鞘抗原活化的髓鞘抗原特異性T細胞,遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。一旦進入中樞神經(jīng)系統(tǒng),這些活化的T細胞就會再次接觸髓鞘抗原,啟動炎癥免疫反應(yīng)導(dǎo)致炎性脫髓鞘。在EAE發(fā)病過程中,MOG肽抗原特異性T細胞(MOG-T細胞)產(chǎn)生,進入中樞神經(jīng)系統(tǒng),引起臨床癥狀,而隨著MOG-T細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)增加,小鼠脊髓炎性細胞浸潤和脫髓鞘加劇,疾病嚴重程度加重,因此疾病嚴重程度與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中浸潤的MOG-T細胞的數(shù)量關(guān)系密切。據(jù)此我們推測在EAE發(fā)病過程中,MOG-T細胞穿過血腦屏障遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng),破壞髓鞘釋放MOG肽,這一過程加速了T細胞的活化和遷移過程,進而加速胸腺中的T細胞發(fā)育過程,加速T細胞發(fā)育過程中的陽性選擇和陰性選擇,DP細胞凋亡加速,促使更多的成熟T細胞釋放到外周,接受抗原遞呈細胞遞呈的MOG肽,活化為MOG-T細胞遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng),形成正向的級聯(lián)放大效應(yīng)。因此疾病嚴重程度可能決定胸腺萎縮程度,活化T細胞的遷移可能導(dǎo)致胸腺的萎縮。萎縮胸腺的可復(fù)性也早有報道[10],對胸腺的可復(fù)性進行研究發(fā)現(xiàn),隨著EAE小鼠病情的緩解,胸腺萎縮減輕,細胞凋亡減少,這進一步驗證了上面的結(jié)果。綜上所述,EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮程度關(guān)系密切,EAE小鼠中活化T細胞的定向遷移可能導(dǎo)致胸腺萎縮。

我們同時觀察到,在EAE小鼠發(fā)病高峰期胸腺淋巴細胞的CD4-CD8-雙陰性階段,隨著疾病嚴重程度的加重,雙陰性細胞比例呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,CD4-CD8-雙陰性細胞亞群凋亡在EAE小鼠中的變化是我們下一步研究的重點。

參考文獻:

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[收稿2015-03-20修回2015-06-05]

(編輯倪鵬)

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