顏秋霞　陳彩蓉　李介華　周秀琴　冼英杰　陳潤強　蔡志明　唐愛發(fā)

(清遠市人民醫(yī)院暨廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院生殖中心，清遠511518)

①本文受廣東省醫(yī)學科研基金(B2014426)、清遠市科技計劃項目(2014B012)、國家自然科學基金(81170613，81270740，81101922)和深圳市基礎研究計劃杰出青年基金項目(JC201005260216A)資助。

②清遠市人民醫(yī)院暨廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院檢驗科，清遠511518。

③深圳大學第一附屬醫(yī)院暨深圳市第二人民醫(yī)院，深圳518035。

[摘　要]　目的：制備和初步鑒定人睪丸特異性新基因hTSC29(GenBank 登錄號: BC032957)合成肽的單克隆抗體(mAb)。方法：利用生物信息學方法對hTSC29的蛋白質序列進行分析和預測，根據(jù)免疫原性、表露性、親疏水性及柔韌性4個參數(shù)，合成一段由18個氨基酸組成的多肽，并以此為抗原免疫 BALB/c小鼠，取其脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合后，通過有限稀釋法篩選陽性克隆，采用ELISA法、Western blot、免疫組化和免疫熒光法鑒定hTSC29 mAb 的特異性。結果：獲得了1株穩(wěn)定分泌hTSC29 mAb的雜交瘤細胞株，分泌的抗體屬IgG2b(κ)亞型，雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價達到1∶104；Western blot鑒定表明，制備hTSC29 mAb可特異性地識別人睪丸總蛋白中Mr約為60 000處的蛋白；免疫組織化學和免疫熒光結果顯示hTSC29蛋白主要定位在正常人睪丸組織中的精母細胞和精子細胞。結論：成功建立了1株穩(wěn)定分泌抗hTSC29 mAb的雜交瘤細胞株，其分泌的抗體效價高、特異性強，為進一步研究hTSC29的功能提供了特異的檢測工具。

[關鍵詞]　人睪丸特異性新基因；合成肽；單克隆抗體

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.014

人睪丸特異性新基因hTSC29合成肽單克隆抗體制備與鑒定①

顏秋霞陳彩蓉李介華②周秀琴冼英杰陳潤強蔡志明③唐愛發(fā)③

(清遠市人民醫(yī)院暨廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院生殖中心，清遠511518)

①本文受廣東省醫(yī)學科研基金(B2014426)、清遠市科技計劃項目(2014B012)、國家自然科學基金(81170613，81270740，81101922)和深圳市基礎研究計劃杰出青年基金項目(JC201005260216A)資助。

②清遠市人民醫(yī)院暨廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院檢驗科，清遠511518。

③深圳大學第一附屬醫(yī)院暨深圳市第二人民醫(yī)院，深圳518035。

[摘要]目的：制備和初步鑒定人睪丸特異性新基因hTSC29(GenBank 登錄號: BC032957)合成肽的單克隆抗體(mAb)。方法：利用生物信息學方法對hTSC29的蛋白質序列進行分析和預測，根據(jù)免疫原性、表露性、親疏水性及柔韌性4個參數(shù)，合成一段由18個氨基酸組成的多肽，并以此為抗原免疫 BALB/c小鼠，取其脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合后，通過有限稀釋法篩選陽性克隆，采用ELISA法、Western blot、免疫組化和免疫熒光法鑒定hTSC29 mAb 的特異性。結果：獲得了1株穩(wěn)定分泌hTSC29 mAb的雜交瘤細胞株，分泌的抗體屬IgG2b(κ)亞型，雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價達到1∶104；Western blot鑒定表明，制備hTSC29 mAb可特異性地識別人睪丸總蛋白中Mr約為60 000處的蛋白；免疫組織化學和免疫熒光結果顯示hTSC29蛋白主要定位在正常人睪丸組織中的精母細胞和精子細胞。結論：成功建立了1株穩(wěn)定分泌抗hTSC29 mAb的雜交瘤細胞株，其分泌的抗體效價高、特異性強，為進一步研究hTSC29的功能提供了特異的檢測工具。

[關鍵詞]人睪丸特異性新基因；合成肽；單克隆抗體

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.014

中圖分類號R392.11

文獻標志碼碼A

文章編號號1000-484X(2015)11-1505-05

作者簡介：顏秋霞(1982年-)，女，助理研究員，主管技師，主要從事男性生殖與遺傳研究,E-mail:yanqiuxia1982@163.com。

通訊作者及指導教師：唐愛發(fā)(1973年-)，男，博士，正研究員，主要從事男性生殖與遺傳研究，E-mail:tangaifa2004@163。

[Abstract]Objective:To prepare monoclonal antibody(mAb) against human testis-specific conserved gene (hTSC29) peptides and characterize its immunological and biological features.Methods: According to bioinformatics analysis and prediction of the antigenicity,surface property,hydrophilicity and flexibility of hTSC29，a 18-amino acid residue partial peptide of hTSC29 was synthesized,then immunized the BALB/c mice for preparing antiserum.The mAb against hTSC29 was produced using the routine hybridoma technique.The properties of the mAb against hTSC29 were identified by ELISA,Western blot and immunohistochemistry staining.Results: After cell fusion and subcloning,one hybridoma cell lines secreting specific mAb against hTSC29 protein were obtaind.The Ig subclass of the mAb was IgG2b(κ).ELISA detection showed that the titer of mAbs in cultured was 1∶104.Western blot analysis proved that the mAb could specifically recognize Mr 60 000 protein in human testis total protein.The hTSC29 protein main located at circumference of spermatocyte and spermatid in human testis tissue by immunohistochemistry staining and immunofluorescence assay.Conclusion: One hybridoma cell lines which can secrete specific mAb against hTSC29 protein with high titers and specificity have been established successfully.The mAb will provide efficient tools for functional studies of hTSC29 expressed in spermatogenesis.

Preparation and characterization of monoclonal antibody against hTSC29 peptides

YANQiu-Xia,CHENCai-Rong,LIJie-Hua,ZHOUXiu-Qin,XIANYing-Jie,CHENRun-Qiang,CAIZhi-Ming,TANGAi-Fa.CenterforReproductiveMedicine,People′sHospitalofQingyuan,theSixthAffiliatedHospitalofGuanyzhouMedicalUniversity,Qingyuan511518,China

[Key words]Human testis-specific conserved gene；Synthesized peptide；Monoclonal antibody

育齡夫婦不育癥的發(fā)生率約為15%，男性生精功能障礙是其中的一個重要原因，約占不育男性的10%[1,2]。哺乳動物包括人和小鼠，其生精細胞發(fā)育成成熟的精子，直至精卵結合形成受精卵，須經(jīng)歷一系列不同于體細胞發(fā)育的生物學事件，包括減數(shù)分裂、姐妹染色單體交換和重組、核固縮、染色質重建、鞭毛形成、精子獲能和頂體反應等[3]。體內這一獨特的生命現(xiàn)象，是大量睪丸特異性表達基因按時空順序表達和睪丸組織內外環(huán)境共同作用的結果，例如CKT2，NANOS2，GRTH/DDX25，Septin12等皆被證明為睪丸特異性表達基因并在精子發(fā)生過程中起重要作用，這些基因的缺失或突變將導致嚴重少精子癥或無精子癥，從而造成不育[4-8]。因此，篩選和鑒定精子發(fā)生相關基因有助于進一步了解人類精子形成的分子機制和部分男性不育的原因。本課題組通過對4、9、18、35、54 d和6個月齡小鼠睪丸和成人睪丸基因組表達譜的Affymetrix芯片進行篩選，并結合RT-PCR實驗和生物信息學分析，篩選出Tsc21、TSG23/Tsg23、TSC24、TSC77等與精子發(fā)生相關的基因[9-12]。此外，還成功篩選出一個人睪丸特異性新基因，并將其命名為hTSC29(Human testis-specific conserved gene)。有關hTSC29基因的單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)制備與鑒定尚未見文獻報道，本文在hTSC29多肽設計和合成基礎上，采用單克隆抗體技術制備針對hTSC29多肽的mAb，將為后期hTSC29蛋白免疫學檢測方法的建立及其研究奠定基礎，使能更深入地研究該基因的表達特征及其在精子發(fā)生過程中的生物功能。

1材料與方法

1.1材料小鼠骨髓瘤細胞系(Sp2/0)購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、次黃嘌呤+氨基蝶呤+胸腺嘧啶核苷(HAT)、次黃嘌呤+胸腺嘧啶核苷(HT)、PEG(1450)和異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗鼠二抗為Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗鼠二抗購自Abcam公司； 3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自科華生物公司；牛血清白蛋白(BSA)購自Merck公司；HBT小鼠單克隆抗體分型試劑盒購自HyCult biotechnology公司；硝酸纖維素膜(PVDF)購自Millipore公司；ECL發(fā)光顯色試劑盒購自Thermo公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。酶標儀(680型)、電泳槽、電泳儀(Mini-protean Teta cell型)和熒光影像掃描儀均為Bio-Rad產(chǎn)品；半干轉膜裝置為Wealtec corp產(chǎn)品；多肽合成以及其與KLH、BSA的偶聯(lián)由西安華辰生物公司完成。BALB/c小鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。成年人睪丸組織取材于意外死亡的健康人，該研究獲得北京大學深圳醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1hTSC29合成肽的設計、合成及與載體KLH和BSA交聯(lián)利用DNAstar軟件對不同種屬的hTSC29氨基酸序列進行多序列比對，分析hTSC29序列的特點，根據(jù)對其免疫原性、表露性、親疏水性及柔韌性4個參數(shù)的預測結果[13]，確定在hTSC29蛋白中選擇一段序列(18個氨基酸)委托西安華辰生物公司合成，質譜分析表明合成的多肽片段與理論的相對分子質量(Mr)一致，經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)分析進行純度鑒定，純度大于95%；采用戊二醛連接法[14]制備多肽-KLH和多肽-BSA的偶聯(lián)物，將5 mg合成多肽分別加入7 mg KLH和BSA中，邊振蕩邊緩慢加入1 ml新鮮配制的3 g/L的戊二醛溶液，室溫作用2 h。以pH8.5硼酸緩沖液透析過夜。交聯(lián)形成的多肽-KLH偶聯(lián)物作為免疫原，而多肽-BSA偶聯(lián)物則用于抗體生產(chǎn)中ELISA篩選。

1.2.2小鼠免疫將多肽-KLH偶聯(lián)物(50 μg/只)加200 μl滅菌PBS與等量的弗氏完全佐劑混合后腹腔注射免疫BALB/c小鼠。2周后使用相同劑量的多肽-KLH與弗氏不完全佐劑充分乳化后，注射小鼠腹腔進行第2次免疫；2周后進行第3次免疫，方法同第2次免疫。第3次免疫后小鼠斷尾進行尾尖采血，4℃，4 000 r/min離心15 min，取上清。以多肽-KLH為檢測抗原，間接ELISA法測定血清效價。選擇血清效價高的小鼠，融合前3 d，用不加佐劑的等量抗原再加強免疫1次，3 d后取小鼠脾細胞制備細胞懸液進行融合。

1.2.3細胞融合、陽性雜交瘤細胞篩選及亞克隆在無菌條件下，選擇生長狀態(tài)良好的Sp2/0細胞與免疫小鼠的脾細胞以1∶5～1∶10的比例混合，1 500 r/min離心5 min，棄上清，輕搖離心管使細胞均勻分散，將離心管置于37℃水浴中，用1 min時間邊振搖邊緩慢加入1 ml 37℃預熱的500 ml/L PEG(1450)。靜置1 min后，緩慢加入20 ml無血清 DMEM培養(yǎng)基進行融合，再次離心，棄上清，細胞沉淀中加入含有200 ml/L胎牛血清的HAT-DMEM選擇培養(yǎng)基輕輕混勻?；靹虻募毎鶆蜾佊陬A先培養(yǎng)了飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，放入37℃、CO2濃度為50 ml/L的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第10天用HT培養(yǎng)基取代HAT培養(yǎng)基，第14天換含100 ml/L胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基。換液后當雜交瘤細胞長至1/2視野時，將多肽-BSA偶聯(lián)物用包被液稀釋至5 mg/L，在酶標板中每孔加100 μl，置4℃過夜。去除包被液，用PBST(PBS+0.5 ml/L Tween-20)洗滌3次，每次5 min。加入雜交瘤上清，37℃孵育1 h。用PBST洗滌3次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育1 h，PBST洗滌后加入TMB顯色液，室溫避光反應5 min，加入終止液，終止反應，酶標儀讀數(shù)(A450/630)。以正常BALB/c小鼠血清作為陰性對照(N)，已免疫BALB/c小鼠血清作為陽性對照(P)，以P/N>2為陽性。選擇陽性值高且細胞集落數(shù)目少的孔，通過有限稀釋技術進行亞克隆，每孔細胞數(shù)目理論值為1～2個。經(jīng)過3～4次亞克隆后，即獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株。將此陽性雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)后，進行細胞凍存和腹水制備。

1.2.4單克隆抗體的制備及其效價測定采用小鼠體內誘生腹水的方法制備單克隆抗體。選用5只6～8周齡健康BALB/c小鼠，先腹腔內注射滅菌液體石蠟，每只0.5 ml。7 d后，收集雜交瘤細胞，離心取上清。加入不含血清的培養(yǎng)基，調節(jié)細胞密度至106個/ml，向每只小鼠腹腔內注射1 ml，8～10 d后，小鼠腹部增大，即可按常規(guī)法收集、制備mAb腹水[15]。以5 mg/L的多肽-BSA偶聯(lián)物包被96孔酶標板，用上述間接ELISA方法檢測腹水的效價。以陽性值與陰性值的比值大于2.0的最大抗體稀釋倍數(shù)確定抗體效價。

1.2.5抗體亞型鑒定采用HBT公司的小鼠單克隆抗體分型試劑盒對所獲得的mAb進行鑒定，具體方法參照說明書進行。

1.2.6mAb特異性檢測(1)Western blot分析：取正常人睪丸組織，剪成細小碎片，細胞漂洗液漂洗1遍，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑，混勻組織，勻漿樣品，冰上孵育30 min后，12 000 r/min離心15 min，獲得正常人睪丸組織裂解液。待子宮內膜細胞和白血病K-562細胞在培養(yǎng)瓶中長成單層后去上清，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑，5 min后刮下細胞，收集于離心管，在冰浴中用超聲細胞破碎儀破碎細胞。12 000 r/min離心15 min，測上清蛋白質濃度。上述3種蛋白加入還原性SDS-PAGE 上樣緩沖液中，于100℃變性10 min，取5 μl進行SDS-PAGE電泳，并轉至PVDF膜上，用10 g/L BSA 4℃封閉過夜。次日依次加入1∶1 000稀釋的mAb，室溫下孵育4 h，TBST(TBS +0.5 ml/L Tween-20)緩沖液洗膜3次，10 min/次，加入1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，室溫下孵育1 h，TBST徹底洗滌后，ECL顯色后，放置在熒光影像掃描儀上曝光，計算機每隔20 s將自動保存檢測到的信號；(2)免疫組化鑒定：按常規(guī)方法處理多聚甲醛固定的人睪丸組織石蠟切片，二甲苯脫蠟后用系列梯度乙醇水化，再浸入30 ml/L H2O2-甲醇溶液，室溫避光孵育20 min，以消除內源性過氧化氫酶的作用。把切片置于10 mmol/L 的檸檬酸鹽緩沖液中，用微波爐加熱(92℃～98℃，15 min)，恢復組織抗原性。正常山羊血清室溫下封閉 30 min，加待測雜交瘤培養(yǎng)上清，4℃孵育過夜。PBST洗滌3次。用S.P法免疫組化試劑盒染色，加Biotin-Goat anti-mouse IgG，孵育1 h，PBST洗滌3次，再加入streptavidin-peroxidase，孵育洗滌同上。DAB顯色后用雙蒸水淋洗凈，經(jīng)蘇木素復染、脫水、透明及封片后，觀察結果。陰性對照采用正常小鼠血清代替雜交瘤上清；(3)免疫熒光檢測：正常人睪丸組織石蠟包埋切片用二甲苯常規(guī)脫蠟、入水、抗原修復。PBS洗滌3次，滴加30 ml/L H2O2-甲醇，室溫孵育20 min，以消除內源性過氧化氫酶的作用。PBS洗滌后滴加正常山羊血清室溫下封閉10 min，加待測雜交瘤培養(yǎng)上清，濕盒內孵育2 h。PBS洗滌3次，加入FITC-羊抗鼠二抗，室溫避光孵育30 min。PBS 洗滌3次，800 g/L甘油封片，鏡檢拍照。陰性對照采用正常小鼠血清代替雜交瘤上清。

2結果

2.1hTSC29多肽的生物信息學分析為了提高抗體的特異性，對hTSC29全長蛋白序列與其他睪丸特異性表達的蛋白進行同源性分析，選取同源性低的片段，再根據(jù)免疫原性、表露性、親疏水性及柔韌性4個參數(shù)的預測結果，最后選取hTSC29的18個(224～241位)氨基酸序列進行合成(見圖1陰影部分)，這18個氨基酸抗原性較高(紫色波)，又在蛋白折疊的表面(黃色波)，兼顧親水性(灰色波)，而且還有結構柔性(藍色波)。

2.2抗hTSC29 mAb雜交瘤細胞株的建立經(jīng)小鼠免疫、小鼠脾細胞與Sp2/0融合、間接ELISA篩選，以P/N>2為陽性，篩選出3株雜交瘤細胞。每株分別進行三次亞克隆，獲得1株穩(wěn)定分泌特異性抗hTSC29 mAb的細胞株，命名為4F9。經(jīng)過1年多反復凍存和復蘇培養(yǎng)，仍能穩(wěn)定地分泌hTS C29 mAb。

2.3mAb亞型鑒定Ig亞型分析結果顯示，該株雜交瘤細胞株分泌的mAb，為IgG2b(κ)亞型。

2.4mAb的特性鑒定

2.4.1Western blot分析Western blot分析可見，該株hTSC29 mAb在人睪丸組織中Mr約為60 000處均可見一條清晰陽性條帶，而子宮內膜細胞蛋白和白血病K-562細胞蛋白均無特異條帶出現(xiàn)。陽性對照GAPDH，均在Mr為36 000處出現(xiàn)了條帶(圖2)。

圖1　hTSC29氨基酸序列4個參數(shù)的預測結果Fig.1　Prediction of antigenicity,surface property,hydrophilicity and flexibility of hTSC29

圖2　Western blot 檢測hTSC29 mAb的特異性Fig.2　Western blot analysis of specificity of hTSC29 mAbNote: 1.AN3CA;2.Leukemic cell K-562;3.Testis.

2.4.2mAb的免疫組化鑒定免疫組化鑒定顯示，正常人睪丸組織中的精母細胞和精子細胞能被TSC29 mAb所識別，呈陽性反應，染色背景清楚，無非特異性染色 (圖3)。

2.4.3mAb的免疫熒光鑒定在熒光顯微鏡下觀察，在人睪丸組織靠近管腔附近的精母細胞和精子細胞中有明顯的綠色熒光，呈環(huán)狀著色，表明hTSC29 mAb能與睪丸中的hTSC29蛋白結合，而正常小鼠血清(陰性對照)在正常人睪丸組織中無熒光出現(xiàn)，提示hTSC29 mAb可特異性識別正常人睪丸組織中的hTSC29蛋白(圖4)。

圖3　hTSC29 的免疫組化定位(×200)Fig.3　Localization of hTSC29 in human testis tissue(×200)Note: A.Negative control normal mouse serum(1∶1 000);B. hTSC29 mAb.

圖4　免疫熒光染色技術檢測hTSC29蛋白在睪丸組織中的表達(×200)Fig.4　Expression of hTSC29 on human testis tissue by immunofluorescence assaya(×200)Note: A.Negative control normal mouse serum(1∶1 000);B.hTSC29 mAb.

3討論

哺乳類動物的精子發(fā)生受多種因素的調控，而生精細胞內的基因水平的調節(jié)，在精子發(fā)生過程中起著決定性的作用。目前，我課題組成功篩選出一個人睪丸特異性新基因hTSC29，該基因定位于人染色體1q23.3位點，其cDNA 長度907 bp，開放閱讀框786 bp，編碼一個由262個氨基酸組成，Mr為29 000 的蛋白質。RT-PCR實驗和生物信息學分析，可推測該基因呈現(xiàn)睪丸特異性表達。研究hTSC29在人類生精過程中的作用，抗體是個有效的檢測工具，它是研究蛋白質的必不可少的工具之一，在一種新的cDNA被克隆后，依據(jù)翻譯出來的氨基酸序列人工合成多肽，并與載體偶聯(lián)后，免疫動物制備其抗體，是一種快速而有效的制備抗體的手段[16]。我們利用生物信息學對hTSC29進行分析，選取抗原性較高、和已知蛋白同源性低的多肽片段，采用固相多肽合成法合成多肽，將其免疫BALB/c小鼠，按照常規(guī)雜交瘤技術最終建立了1株雜交瘤細胞系(4F9)。經(jīng)過1年多反復凍存和復蘇培養(yǎng)，仍能穩(wěn)定的分泌hTSC29 mAb，并已由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC-C 200952。

合成肽常能誘生出高滴度的抗體，而且可以很好地與變性蛋白結合，能識別抗原的某一特定區(qū)域(表位)，在蛋白質研究中有很多優(yōu)點。在制備抗肽抗體中,經(jīng)常碰到的問題是這種抗體能否識別天然蛋白(native protein)，如果不能，則它們在Western blot、免疫組化及免疫熒光中的應用就受到限制?？贵w的效價、與抗原結合的特異性以及親和力是判斷其質量的標準。本試驗用上述3種技術Western blot、免疫組化和免疫熒光實驗鑒定hTSC29 mAb，均獲得陽性結果。這些結果說明hTSC29 mAb具有很好的親和力和特異性，不僅能特異識別相應靶蛋白的線性表位，而且能識別天然構象的內源性蛋白。然而，hTSC29的Mr約為29 000，但是Western blot 結果顯示，hTSC29 mAb識別的是人睪丸組織中Mr約為 60 000的蛋白，極有可能是hTSC29蛋白序列的 C末端有4個亮氨酸殘基形成的亮氨酸拉鏈結構所造成的，因為具有亮氨酸拉鏈結構的分子通常以二聚體的形式存在[17]。因此，Mr約為 60 000的蛋白可能是hTSC29的二聚體形式，但hTSC29蛋白和hTSC29 mAb確切的作用機制，還有待下一步的研究確證。

總之，通過設計合成多肽來快速制備抗體為新基因功能的研究提供了強有力的檢測工具。hTSC29基因與精子發(fā)生密切相關，高質量hTSC29 mAb的成功制備將為進一步在蛋白質水平上研究hTSC29在人類精子發(fā)生中的機制和由男性嚴重少弱精子癥或無精子癥引起不育的基因診斷提供了重要的工具。

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[收稿2014-12-23修回2015-06-07]

(編輯張曉舟)