林佳華

【摘要】目的：研究分析乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白（英簡HBXIP）對肝癌細胞核因子（英簡NF-KB）轉(zhuǎn)錄活性的影響。方法：應用基因共轉(zhuǎn)染把NF-KB報告基因質(zhì)粒HBXIP、pNF-KB-Luc真核表達載體（即為pcDNA3-hbxip）導入人肝癌細胞（H7402）系內(nèi)，通過熒光素酶活性進行分析。結(jié)果：肝癌H7402細胞過表達HBXIP以后，明顯提高了NF-KB轉(zhuǎn)錄活性；肝癌H7402細胞內(nèi)HBXIP過表達以后，p65/NF-KB在細胞核內(nèi)的含量顯著增多。結(jié)論：乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白能提高細胞核中p6 5/NK-KB蛋白的含量，具有良好的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，以利于細胞增殖。

【關鍵詞】乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白；肝癌細胞

乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白是具有十分重要的生物活性的一種組成型蛋白質(zhì)，其由91個氨基酸構(gòu)成。以往研究發(fā)現(xiàn)，HBXIP能夠與HBX（乙肝病毒X蛋白）的C端發(fā)生特異性結(jié)合，進而減小HBX的活性，同時使HBX病毒復制周期發(fā)生改變。HBXIP既可以對HBX蛋白誘導細胞凋亡的途徑進行抑制，并且還能調(diào)節(jié)細胞周期而增加細胞增殖。為了深入了解HBXIP增加細胞增殖的作用機制，針對HBXIP蛋白對NFKB轉(zhuǎn)錄活性的影響進行了進一步探究，具體如下。

1、資料與方法

1.1一般資料

真核表達載體pEGFP-c2、pcDNA3均保存在本室；NF-KB熒光素梅報告基因質(zhì)粒（即為pNF-KB-Luc）由Promega公司提供；人肝癌細胞系H7402源于市醫(yī)院。

1.2方法

將真核表達載體與報告基因質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染導入H74002細胞內(nèi)，待轉(zhuǎn)染40小時后，根據(jù)照熒光素酶試劑盒的說明書指示，溶入適量的裂解緩沖液，在常溫下反應15分鐘，然后將細胞裂解的產(chǎn)物刮下，再轉(zhuǎn)移至1.5ml規(guī)格的離心管內(nèi)，離心速為14000r/min，離心時間15秒。將上清液置于另一個同樣規(guī)格的離心管內(nèi)。每隔離心管內(nèi)含有熒光素酶測定緩沖液，劑量為100μl，并加入100μl的細胞裂解液，即刻混勻。應用熒光光度計檢測10秒鐘，光輸出后再加入熒光淬滅劑，劑量為100u1，強螢火蟲熒光素酶徹底淬滅，然后開始海腎熒光素酶反應，計算10秒后的光輸出值。

應用PBS對細胞進行重復洗滌2次，然后緩慢注入裂解液A，劑量為400μ1。冰浴10分鐘，然后再加入NP-40，劑量為16μ1，混合均勻，10秒鐘后繼續(xù)冰浴，時間為10分鐘。在4攝氏度環(huán)境下，離心2分鐘，離心速度為12000r/min。如果有沉淀，則繼續(xù)加入裂解液A，劑量為500μ1，再次洗滌，然后4攝氏度環(huán)境離心，時間為2分鐘，舍棄上清液。沉淀加入事先預冷的裂解液B，冰浴處理，時間為20分鐘，然后4攝氏度環(huán)境進行離心，時間為12分鐘，離心速度為14000r/min。對上清液進行定量分析，同時實施免疫印跡實驗檢查。

通過預冷的PBS對細胞進行2次洗滌，再加入細胞裂解液，置于冰上，時間為20分鐘。在4攝氏度環(huán)境下進行離心處理，時間為20分鐘，離心速度為12000r/min，取上清液進行定量分析。取35g左右的總蛋白實施12%SDS-PAGE實驗，通過電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5.0%濃度的脫脂奶粉進行封閉，時間為1小時。然后，加入一抗，置于室溫孵育，時間為2-3小時，應用PBST洗膜。分別加入抗兔IgG、抗鼠IgG在室溫下孵育一個小時，再用PBST洗膜，應用增強型ECT試劑盒，放置在暗室進行曝光顯影。

2、結(jié)果

通過雙熒光檢測儀實驗發(fā)現(xiàn)，HBXIP基因過表達可以明顯提高NF-KB轉(zhuǎn)錄活性；提取核蛋白后，通過免疫印跡檢查，HBXIP過表達以后，細胞核內(nèi)p65/NF-KB的含量有所改變。瞬時轉(zhuǎn)染HBXIP基因后，能夠顯著提高H7402細胞核內(nèi)p65/NF-KB的水平。

3、討論

NF-KB是人體細胞中十分重要的一種核轉(zhuǎn)錄因子，以調(diào)控多種基因的表達實現(xiàn)細胞增殖、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生、免疫反應的參與。當細胞處于靜息狀態(tài)時，NF-KB通過無活性的狀態(tài)存活在細胞質(zhì)內(nèi)，并與特定的KB序列相結(jié)合，同時能夠集合協(xié)同因子起到調(diào)控轉(zhuǎn)錄的作用。通過熒光素酶報告檢查發(fā)現(xiàn)，HBXIP過表達能夠增強NF-KB轉(zhuǎn)錄活性。通過提取H7402細胞內(nèi)的核蛋白，進行免疫印跡實驗觀察，細胞核中的p65/NF-KB水平顯著升高。由此推斷，乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白能提高細胞核中p65/NK-KB蛋白的含量，具有良好的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，以利于細胞增殖。