陳培生，鄧三花，王偉飛，何鋒堅，何 瓊，岳 輝

南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州510630

胰腺癌是消化系統(tǒng)高度惡性的腫瘤，嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，胰腺癌早期診斷困難，手術(shù)切除率低，近90%的患者在確診胰腺癌后1 年內(nèi)死亡，而5 年生存率不足5%，是消化系統(tǒng)腫瘤中預后最差，有“癌中之王”之稱［1-2］。由于傳統(tǒng)的治療方法有其自身的局限性，因此，尋找胰腺癌的新治療方法成為當務之急。本研究利用能特異誘導腫瘤細胞凋亡的重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trai 及胰腺癌化療中的金標準化療藥-吉西他濱，觀察兩者聯(lián)合作用誘導胰腺癌細胞凋亡的情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及抗體 質(zhì)粒小量提取試劑盒、Lipofectmine-LTX 轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen);小牛血清(四季清公司);兔抗Trail 單克隆抗體(CST);辣根過氧化酶標記山羊抗兔二抗(中杉金橋公司);吉西他濱(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，純度99%以上)。

1.2 菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細胞(天根公司);重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trail(含有Survivin340 啟動子序列及全長Trail cDNA 序列)由本實驗室保存。

1.3 細胞 SW1990 胰腺癌細胞由本實驗室保存。用10%滅活小牛血清的新鮮RPMI 1640 培養(yǎng)，37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及Western blotting 檢測 用lipofectamine-LTX 轉(zhuǎn)染試劑盒將重組質(zhì)粒pcDNA3. 1/SurP/Trail 導入SW1990 胰腺癌細胞中。轉(zhuǎn)染72 h 后檢測各組細胞中Trail 表達的情況，將上清液、純化后的蛋白和蛋白標準樣品進行SDS-PAGE 電泳，用Western blotting Chemiluminescence 試劑盒檢測各組細胞Trail 的表達。

1.5 雙標記流式細胞術(shù)分析細胞凋亡 將SW1990胰腺癌細胞分為4 組，聯(lián)合組:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/SurP/Trail 重組質(zhì)粒并加入20 μmol/L 吉西他濱;重組質(zhì)粒組:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒;吉西他濱組:加入20 μmol/L 吉西他濱;空白對照組:未加任何處理。處理48 h 后收集各組細胞，參照Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒提供方法，處理細胞后用雙標記流式細胞術(shù)分析各組細胞的凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用s 表示，組間多重比較采用Bonferroni 方法分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blotting 檢測Trail 在各組SW1990 胰腺癌細胞的表達 重組質(zhì)粒組及聯(lián)合組均有Trail 蛋白表達，吉西他濱組和空白對照組則無Trail 蛋白表達(見圖1)，說明SW1990 胰腺癌細胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后能特異性表達Trail 蛋白。

圖1 Western blotting 檢測Trail 蛋白表達的情況 1:聯(lián)合組;2:重組質(zhì)粒組;3:吉西他濱組;4:空白對照組Fig 1 Trail protein expression in four group by Western blotting cells 1:the combination group;2:the recombinant plasmid group;3:the gemcitabine group;4:the control group

2.2 雙標記流式細胞術(shù)分析各組SW1990 胰腺癌細胞的凋亡率 經(jīng)處理后，聯(lián)合組、重組質(zhì)粒組、吉西他濱組、空白對照組SW1990 胰腺癌細胞的凋亡率(%)分別為10.59±0.64、5.05 ±0.50、4.95 ±0.51、2.67 ±0.34。聯(lián)合組的SW1990 胰腺癌細胞凋亡率明顯高于其他組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);重組質(zhì)粒組與吉西他濱組的細胞調(diào)亡率相比，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05);重組質(zhì)粒組和吉西他濱組與空白對照組比較，細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

3 討論

近些年來，隨著分子生物學及分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因治療逐漸成為近幾年研究的熱點，尤其是腫瘤的基因治療已成為腫瘤生物治療研究的熱點，靶向性是基因治療中有待解決的難點，因此，選擇能在腫瘤細胞中特異表達的殺傷基因成為基因治療的關(guān)鍵。腫瘤殺傷基因的靶向性表達原理是將具有腫瘤特異性的啟動子序列與腫瘤殺傷基因相偶聯(lián)，使帶有啟動子的腫瘤殺傷基因只在腫瘤細胞中表達，從而減輕對正常組織的損傷。

Survivin 啟動子可用作腫瘤靶向治療的工具，啟動下游殺傷基因特異性表達于腫瘤細胞，從而避免損傷正常細胞。研究已證實Survivin 啟動子在腫瘤細胞中的活性超過了分子生物學實驗中常用的高活性工具啟動子—病毒SV40 啟動子的2 ～3 倍［3］。許多研究已證實Trail 蛋白具有殺傷腫瘤細胞的特異性［4］，其與受體DR4 和DR5 結(jié)合可誘導細胞凋亡，而Ozawa 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中DR4 和DR5 的mRNA 水平明顯高于正常胰腺組織的表達［6］，Tan 等［7］也發(fā)現(xiàn)5種胰腺癌細胞株高水平表達誘導凋亡的DR4 和DR5。吉西他濱是近年研制的新型嘧啶類似物，它的出現(xiàn)使胰腺癌的化療取得了突破性的進展，Oettle 等［8］進行了一項對比吉西他濱和5-Fu 的Ⅲ期臨床研究，結(jié)果顯示，吉西他濱單藥化療在臨床獲益和生存期方面，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的5-Fu。因此，吉西他濱被美國FDA 批準為胰腺癌治療中的金標準化療藥［9-10］。

本研究中，我們將能特異性誘導腫瘤細胞凋亡的重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trail 及吉西他濱聯(lián)合，并共同作用于胰腺癌細胞，通過研究結(jié)果顯示，聯(lián)合組、重組質(zhì)粒組及吉西他濱組SW1990 細胞均出現(xiàn)凋亡，且聯(lián)合組凋亡率均顯著高于其他兩組。提示重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trail 與吉西他濱聯(lián)合具有協(xié)同作用，并能更有效促進SW1990 胰腺癌細胞的凋亡。

但是，本研究在深度及廣度上還需繼續(xù)改善，并計劃進一步在胰腺癌的裸鼠模型中評價其安全性和有效性。

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