孟 瑩，朱圣韜，李 鵬，張澍田

首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院消化科，國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心，北京市消化疾病中心，消化疾病癌前病變北京市重點實驗室，北京100050

分泌型卷曲蛋白家族(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)是Wnt 信號途徑的調(diào)節(jié)劑，可通過競爭性抑制Frizzled 受體而抑制Wnt 的活動，參與多種腫瘤的發(fā)生。近年來，多個研究發(fā)現(xiàn)SFRP1 基因啟動子區(qū)高甲基化導致的基因沉默可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)［1-3］。本研究目的是觀察SFRP1 基因表達及啟動子區(qū)甲基化在食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中的表達情況，探討DAC 及TSA 對SFRP1 基因表達的影響，從而進一步明確SFRP1 基因在ESCC 發(fā)病機制中的作用，為ESCC 的診治提供新的可能的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1. 1 細胞:人類ESCC 細胞株EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13 由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所惠贈。Heec購自Sciencell(美國)，Het-1A 細胞購自ATCC(美國)。1.1.2 主要試劑和藥品:5-氮雜脫氧胞苷(DAC)和曲古抑菌素(TSA)購自Sigma 公司;Anti-acetyl-Histone H3 和H4 購自Millipore 公司;染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒購自Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13 細胞株經(jīng)復蘇后于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)并傳代。Heec、Het-1A 復蘇后于各自專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測SFRP1 mRNA 表達:按TRIzol 試劑說明書提取各細胞系總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，GAPDH 作為內(nèi)參照，其引物及退火溫度見表1。

表1 引物序列表Tab 1 Sequences for primers used in this study

1.2.3 DNA 提取及亞硫酸鹽修飾:使用細胞基因組DNA 提取試劑盒(TIANGEN DP208，中國)，按說明書進行。亞硫酸鹽修飾采用CpGenome DNA 修飾試劑盒(Chemicon，CA，USA)，按說明書進行。修飾好的DNA 用于進一步的測序和MSP 分析。

1.2.4 甲基化分析:甲基化特異性PCR 方法(methylation-specific PCR，MSP)分析組織SFRP1 基因甲基化狀態(tài)。引物序列見表1，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)條件95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR 產(chǎn)物條帶的位置。

1.2.5 DAC 及TSA 處理EC9706 細胞:EC9706 細胞株保存于液氮中，臨用前取出復蘇，含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，按常規(guī)方法置于37℃、5% CO2混合氣體恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞每1 ～2 d 換液一次。每2 ～3 d 以0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶4傳代，接種在新培養(yǎng)瓶內(nèi)。

單獨給藥時，將EC9706 細胞株分別與去甲基化制劑DAC 10 μmol/L 及組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 共同孵育24 h 和72 h。DAC、TSA 聯(lián)合應(yīng)用時，則將DAC 10 μmol/L 與EC9706 細胞株共同孵育72 h 后加用TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L與EC9706 細胞株共同孵育24 h。各濃度藥物處理細胞后，每24 h 更換含藥物的培養(yǎng)液一次。用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況及形態(tài)學變化，并且提取細胞總RNA 及用RT-PCR 方法檢測SFRP1 mRNA 表達恢復情況。

1.2.6 染色質(zhì)免疫共沉淀方法檢測EC9706 細胞組蛋白乙?；闆r:采用ChIP 試劑盒進行檢測，按說明書進行。計數(shù)大約3 ×106EC9706 細胞，甲醛交聯(lián)組蛋白和DNA，超聲破碎細胞和剪切DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定超聲破碎效果。加入乙?；M蛋白H3 抗體或乙?；M蛋白H4 抗體沉淀，收集抗體綁定的組蛋白-DNA 復合物，逆轉(zhuǎn)組蛋白-DNA 交聯(lián)，用蛋白酶K 處理和純化DNA，設(shè)計SFRP1 啟動子區(qū)域的引物，引物序列見表1，PCR 方法鑒定已純化的DNA，并用2%瓊脂糖凝膠電泳，回收瓊脂糖凝膠PCR 產(chǎn)物，連接T 載體，進行產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及藍白斑篩選，鑒定陽性重組子和測序確認。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料用s 描述，兩組間變量比較采用t 檢驗。率的比較采用χ2檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC 細胞系及永生化食管上皮細胞系中SFRP1 mRNA 的表達 EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13細胞株中均未見SFRP1 mRNA 表達，而Het-1A、Heec中可見其表達(見圖1)。

2.2 ESCC 細胞株及永生化食管上皮細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài) MSP 方法檢測ESCC細胞株及永生化食管上皮細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)(見圖2)。EC109、EC9706、KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13均只見M 條帶、U 條帶未見;Het-1A、Heec U 條帶亮，M 條帶隱約可見;KYSE70 均可見U 和M 條帶。

圖1 ESCC 各細胞系及永生化食管上皮細胞系中SFRP1 基因的RT-PCR 電泳圖Fig 1 Expression of the SFRP1 gene in ESCC cell lines，with GAPDH as a control

圖2 MSP 方法示ESCC 各細胞株及永生化食管上皮細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)凝膠電泳圖 U:非甲基化條帶;M:甲基化條帶Fig 2 Promoter hypermethylation of SFRP1 gene was shown in ESCC cell lines and two immortalized human esophageal epithelial cell lines (Het-1A and Heec) U:unmethylated;M:methylated

2.3 DAC 和TSA 干預對ESCC 細胞的影響 根據(jù)各株細胞SFRP1 表達水平及啟動子區(qū)甲基化水平差異，選擇高甲基化同時SFRP1 mRNA 無表達的EC9706 細胞株作為進一步研究對象。去甲基化制劑DAC 10 μmol/L 或組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 分別單獨與EC9706 細胞株共同孵育72 h 和24 h 后，用RT-PCR 檢測細胞株中SFRP1 mRNA 表達恢復情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EC9706 細胞株SFRP1 mRNA 無明顯變化(見圖3A)。DAC 10 μmol/L 和TSA 聯(lián)合應(yīng)用，即DAC 10 μmol/L 與EC9706 細胞株共同孵育72 h 后加用TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 與EC9706 細胞株共同孵育24 h，再次檢測細胞株中SFRP1 mRNA 表達恢復情況，結(jié)果可見EC9706 細胞株SFRP1 mRNA 恢復表達(見圖3B)。

2.4 EC9706 細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)組蛋白乙?；癄顟B(tài) 采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)分析EC9706 細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)域組蛋白乙?；癄顟B(tài)。分別用乙?；M蛋白H3 抗體、乙?；M蛋白H4 抗體沉淀DNA 作為模板進行PCR，兔IgG 作為陰性對照，每次實驗均帶有內(nèi)對照(Input)。PCR 鑒定結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4 所示。PCR 產(chǎn)物回收后進行連接測序，結(jié)果符合SFRP1 基因啟動子區(qū)序列。

圖3 DAC 和TSA 干預對EC9706 細胞株中SFRP1 mRNA表達影響的RT-PCR A:DAC 和TSA 單獨干預EC9706 細胞株中后，未見EC9706 細胞株SFRP1 mRNA 表達恢復;GAPDH:內(nèi)參照;B:DAC 10 μmol/L 與TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 聯(lián)合干預后，可見EC9706 細胞株SFRP1 mRNA 表達恢復Fig 3 Re-expression of SFRP1 mRNA in EC9706 after treatment with DAC and/or TSA by RT-PCR A:EC9706 cells were treated with DAC and TSA alone，with GAPDH as a control;B:EC9706 cells were treated with DAC and TSA together

圖4 EC9706 細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)域組蛋白H3、H4 乙酰化狀態(tài)ChIP 結(jié)果 H3Ac、H4Ac:實驗對象;NAC:陰性對照;IN:內(nèi)對照Fig 4 Histone modification analysis at CpG islands of the SFRP1 promoter region by ChIP assay H3Ac，H4Ac:experimental object;NAC:negative control;IN:internal control

3 討論

SFRP1 基因位于染色體8p12-11.1，該位點在多種腫瘤中缺失，被認為可能是一個抑癌基因［4-5］。抑癌基因表達沉默是腫瘤發(fā)生過程中一個重要的發(fā)病機制，而DNA 甲基化是抑癌基因表達沉默的重要途徑。Suzuki 等［2-3］研究認為啟動子區(qū)高甲基化所介導的轉(zhuǎn)錄沉默是結(jié)直腸癌SFRP1 水平降低的主要機制;乳腺癌中也可見類似的研究結(jié)果。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)SFRP1 基因作為一個可能的抑癌基因，在ESCC 細胞株中完全不表達，而在永生化食管上皮細胞中可以檢測到該基因的明顯表達，表明該基因存在轉(zhuǎn)錄水平表達改變，提示SFRP1 基因可能作為一個抑癌基因，在ESCC 發(fā)病機制中發(fā)揮一定作用。同時，MSP 研究發(fā)現(xiàn)，ESCC 腫瘤細胞系中存在SFRP1 基因啟動子區(qū)高甲基化，而在永生化人類食管上皮細胞系中甲基化程度極低。提示啟動子區(qū)甲基化可能與ESCC 中SFRP1 基因的表達異常相關(guān)。Ishii等［6］研究發(fā)現(xiàn)SFRP1 在ESCC、上皮內(nèi)瘤變及正常組織中均存在啟動子區(qū)高甲基化，甲基化程度呈逐漸降低趨勢，這和我們的研究結(jié)果相一致。

研究表明DNA 高甲基化可被許多因素調(diào)控，去甲基化制劑是最常見的一種干預手段，可使部分表達沉默的抑癌基因表達恢復。5 氮雜脫氧胞苷是有效的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能時間和劑量依賴性地引起CpG 島過甲基化的抑癌基因去甲基化，從而恢復其mRNA 和蛋白質(zhì)的表達，在基因表達調(diào)控、DNA 修復、基因穩(wěn)定等方面起重要作用［7］。TSA 是一種常用的組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑，能夠抑制HDAC 活性，使組蛋白高度乙?；源藖碚{(diào)節(jié)基因表達。近年來，研究發(fā)現(xiàn)CpG 島甲基化和組蛋白修飾既可獨立存在，也能相互影響［8］。有研究認為，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑聯(lián)合應(yīng)用對恢復抑癌基因表達的作用可高于單獨應(yīng)用某一種［9-10］。

我們選擇SFRP1 基因mRNA 不表達且同時存在基因啟動子區(qū)高甲基化的EC9706 細胞株作為進一步研究對象，單獨給予DAC 及TSA 處理，均未能恢復SFRP1 基因的表達;但聯(lián)合DAC 和TSA 共同處理該細胞株后，SFRP1 基因表達卻得到了恢復，表明基因啟動子區(qū)甲基化和組蛋白乙酰化修飾可能共同參與了SFRP1 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。國內(nèi)外其他研究也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用DAC 及TSA 可有效恢復Wnt 相關(guān)基因mRNA 再表達［11-12］。

為進一步說明組蛋白乙?；虳NA 甲基化共同參與了SFRP1 在EC9706 細胞中的轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控過程，我們還用ChIP 方法以乙?；M蛋白H3、H4 抗體免疫沉淀染色質(zhì)片段，然后PCR 擴增SFRP1 基因啟動子區(qū)，擴增出SFRP1 基因啟動子區(qū)片段后進行克隆測序，測序結(jié)果證實為SFRP1 基因啟動子區(qū)序列，從而表明SFRP1 基因啟動子區(qū)結(jié)合有乙?；M蛋白H3 及H4，進一步說明組蛋白乙?；虳NA 甲基化共同參與了SFRP1 在EC9706 細胞中的轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控過程。

綜上所述，本研究結(jié)果證實，ESCC 中存在SFRP1基因的表達下調(diào)和SFRP1 基因啟動子區(qū)高甲基化及組蛋白乙酰化，去甲基化制劑DAC 和HDAC 抑制劑共同作用可恢復SFRP1 基因轉(zhuǎn)錄表達。從實驗中我們可以進一步推測，SFRP1 基因作為一個可能的抑癌基因，其異常表達和啟動子區(qū)高甲基化可能通過Wnt 通路參與了ESCC 的發(fā)病過程，未來可能為ESCC 患者的診治提供新的方向，但仍需要進一步的實驗及臨床研究來證實。

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