奧沙利鉑聯(lián)合地塞米松對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響

李力，鄧敏

(湖北省武漢市普仁醫(yī)院，湖北武漢430081)

摘要：目的：研究奧沙利鉑聯(lián)合地塞米松對(duì)肺腺癌A549/DDP細(xì)胞及肺腺癌患者外周純化Th17細(xì)胞的影響。方法：使用不同濃度的奧沙利鉑(0.3125μg/mL、0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)及地塞米松(1nmoL/L、10nmoL/L、100nmoL/L、200nmoL/L、500nmoL/L、1000nmoL/L)在不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)干預(yù)人肺腺癌A49/DDP細(xì)胞及Th17細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果：在1nmoL/L～200nmoL/L時(shí)地塞米松對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用，500～1000nmoL/L的濃度范圍內(nèi)，地塞米松以劑量依賴性方式抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖，并表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系(r=0.282，P<0.05)；且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率逐漸增加，呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性。在0.3125～1.25μg/mL奧沙利鉑肺腺癌A549細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用，2.5～10μg/mL奧沙利鉑以時(shí)間及劑量依賴性對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)5μg/mL及10μg/mL奧沙利鉑作用于肺腺癌A549細(xì)胞細(xì)胞72h后，抑制率分別為61.12±0.98%、63.67±0.18%，抑制作用相當(dāng)(P>0.05)。連續(xù)給藥24h、48h、72h后發(fā)現(xiàn)干預(yù)24h后即對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，聯(lián)合用藥組OD值明顯低于單用組，即聯(lián)合用藥其抑制率顯著高于其他單用組，且趨勢(shì)隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸明顯。結(jié)論：地塞米松聯(lián)合奧沙利鉑聯(lián)合用藥能產(chǎn)生協(xié)同作用，抑制A549細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：肺腺癌;地塞米松;奧沙利鉑;增殖抑制

文章編號(hào)：1006-6233(2015)11-1774-04

基金項(xiàng)目：*國(guó)家自然科學(xué)基金，(編號(hào)：Q2007C02)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)屬于腺癌最常見(jiàn)的肺癌病理類型也是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。據(jù)臨床研究表明NSCLC具有高度異質(zhì)性，能夠抵抗化療藥物的治療，5年死亡率高達(dá)80%[1]。雖然關(guān)于NSCLC癥的知識(shí)不斷增多，但有關(guān)NSCLC的發(fā)病機(jī)制仍不明確，仍很難確定肺癌的異質(zhì)性和耐藥性的發(fā)病基礎(chǔ)。地塞米松屬于腎上腺皮質(zhì)激素類藥，具有理想的抗炎、抗過(guò)敏和抗毒效應(yīng)，目前被廣泛運(yùn)用于炎癥、哮喘等疾病，并隨著腫瘤研究的不斷深入，地塞米松逐漸在抗腫瘤領(lǐng)域被推廣，有文獻(xiàn)顯示：地塞米松可以增強(qiáng)腫瘤患者對(duì)于化療的敏感性，從而提高藥物的抗腫瘤作用。奧沙利鉑作為目前最重要化療藥物之一被頻繁地運(yùn)用于NSCLC的治療，但其作用機(jī)制也眾說(shuō)紛紜。腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡之間的平衡趨向決定腫瘤的發(fā)生發(fā)展。凋亡過(guò)程受到機(jī)體癌基因與抑癌基因的雙重調(diào)控，直接參與新陳代謝過(guò)程中細(xì)胞數(shù)目的調(diào)節(jié)，一旦凋亡受阻將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖而引發(fā)癌癥，因此猜想地塞米松及奧沙利鉑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)是否是通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。本研究旨在分析奧沙利鉑及地塞米松對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響，匯報(bào)如下：

1資料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株:人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞，由上海生命科學(xué)院提供。按照WHO肺癌分型標(biāo)準(zhǔn)及UICC(2009年)新的國(guó)際肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)分型，將本院2009年1月至2013年1月50例NSCLC患者納入研究并設(shè)為觀察組，其中男性23例，女性27例，年齡28～76歲，平均(46±8.2)歲。患者住院前均未接受化療，同期20例健康體檢者設(shè)為對(duì)照組，其中男性11例，女性9例，年齡27～75歲，平均(45±7.7)歲。兩組在年齡、性別等一般情況比較方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2藥物:奧沙利鉑注射液(生產(chǎn)廠家：南京制藥廠,規(guī)格：20mg/20mL*支,批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030675,生產(chǎn)批號(hào)：20110111～20140111)。地塞米松注射液(生產(chǎn)廠家：天津金耀藥業(yè)有限公司,規(guī)格：1mL:1mg*支,批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥字H120210514)

1.1.3主要試劑和儀器:RPMI 1640和胎牛血清(美國(guó)Thermo公司)；佛波酯(PMA)、離子霉素(Ion)、莫能菌素(Mon)、破膜劑、CD4-FITC、IL-17A-APC流式抗體；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo labsystem公司；BD FACSVerse System，美國(guó)BD Biosciences公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)方法:常規(guī)復(fù)蘇肺腺癌A549細(xì)胞細(xì)胞株，以1640培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)培養(yǎng)于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱，胰酶消化傳代一次。

1.2.2細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn):細(xì)胞吹打成懸液，密度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，每孔200μL均勻接種于96孔板中，按地塞米松(濃度分別設(shè)1nmoL/L、10nmoL/L、100nmoL/L、200nmoL/L、500nmoL/L、1000nmoL/L)、奧沙利鉑(濃度分別為0.3125μg/mL、0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)考察各藥體外最佳濃度，再根據(jù)藥物最佳濃度將實(shí)驗(yàn)空白組、溶劑組、地塞米松組、奧沙利鉑組、地塞米松+奧沙利鉑組以脂多糖進(jìn)行干預(yù)，24h后，每孔加入相應(yīng)藥液，37℃5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，24h后每孔加入5g/LMTT 20μL，放入孵箱繼續(xù)孵育4h，棄上清液，每孔加入DMSO 150μL，震蕩10min，用全自動(dòng)酶標(biāo)光度儀在490nm波長(zhǎng)下讀取吸光度A值，記錄結(jié)果。

2結(jié)果

2.1不同濃度的地塞米松在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響:在1nmoL/L～200nmoL/L時(shí)地塞米松對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用，500nmoL/L～1000nmoL/L的濃度范圍內(nèi)，地塞米松以劑量依賴性方式抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖，并表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系(r=0.282，P<0.05)；且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率也是逐漸增加，呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性。見(jiàn)表1。

表1　不同濃度不同時(shí)間點(diǎn)地塞米松(DEX)對(duì)A549增殖的影響

2.2不同濃度的奧沙利鉑在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響:在0.3125～1.25μg/mL奧沙利鉑肺腺癌A549細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用，2.5～10μg/mL奧沙利鉑以時(shí)間及劑量依賴性對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)5μg/mL及10μg/mL奧沙利鉑作用于肺腺癌A549細(xì)胞細(xì)胞72h后，抑制率分別為61.12±0.98%、63.67±0.18%，抑制作用相當(dāng)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　不同濃度不同時(shí)間點(diǎn)奧沙利鉑對(duì)A549增殖的影響 ±s，n=6)

2.3聯(lián)合用藥對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響:因此聯(lián)合用藥時(shí)地塞米松以1000ng/mL進(jìn)行，奧沙利鉑以5μg/mL濃度進(jìn)行下一步考察。基于此，繼續(xù)將研究分為空白組，溶劑組、地塞米松組(1000ng/mL)、奧沙利鉑組(5μg/mL)以及地塞米松+奧沙利鉑組，連續(xù)給藥24h、48h、72h后發(fā)現(xiàn)干預(yù)24h后即對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，聯(lián)合用藥組OD值明顯低于單用組，即聯(lián)合用藥其抑制率顯著高于其他單用組，且趨勢(shì)隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸明顯，見(jiàn)表3。

表3　聯(lián)合用藥不同時(shí)間對(duì)A549的增殖影響 ±s)

3討論

我國(guó)每年肺癌新發(fā)病例約有21萬(wàn)例，且每年死于肺癌的國(guó)人約為60萬(wàn)[4，5]。晚期非小細(xì)胞肺癌在臨床上占80%～85%[6，7]，其中肺腺癌是最常見(jiàn)的病理類型，占晚期非小細(xì)胞肺癌的將近70%。奧沙利鉑(Oxaliplatin)為鉑類抗腫瘤藥物，通過(guò)與DNA的烷基化作用從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，因其安全性優(yōu)于順鉑、腫瘤親和性優(yōu)于卡鉑，奧沙利鉑現(xiàn)已替代順鉑及卡鉑成為第三代鉑類抗腫瘤藥物，為治療多種實(shí)體瘤的一線用藥。大量臨床研究證明，以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療可顯著延長(zhǎng)晚期非小細(xì)胞肺癌的生存期，改善其生活質(zhì)量[8]，但由于其對(duì)人體的毒性，不良反應(yīng)也較多，且劑量需要合理把握。地塞米松因具有明顯抗炎抗過(guò)敏效果而被廣泛認(rèn)識(shí)，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，地塞米松促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的效能被逐漸挖掘，其通過(guò)阻滯腫瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞膜變性壞死、抗血管新生等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)地塞米松可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，但是不同學(xué)者對(duì)于聯(lián)合用藥的劑量尚存在爭(zhēng)議，基于此，本試驗(yàn)采用體外研究方法，探討二者聯(lián)合用藥協(xié)同抗人肺腺癌的部分機(jī)制及用量。

本實(shí)驗(yàn)中，地塞米松、奧沙利鉑分別以不同濃度及不同時(shí)間點(diǎn)作用與A549細(xì)胞后我們發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)斡玫厝姿蓵r(shí)當(dāng)濃度低于500ng/mL時(shí)反而會(huì)促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞增殖，當(dāng)濃度達(dá)到500ng/m后地塞米松對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率呈濃度及時(shí)間依賴性。奧沙利鉑對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制效應(yīng)具有明顯的時(shí)間及濃度依賴性，當(dāng)藥物濃度處于5μg/mL及10μg/mL時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用相當(dāng)，因此我們認(rèn)為地塞米松以劑量為1000ng/m，奧沙利鉑5μg/mL抑制作用最佳，因此可推測(cè)地塞米松、奧沙利鉑在體外均能明顯抑制A549細(xì)胞的增殖；當(dāng)二藥聯(lián)合給藥以后發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組的抑瘤率顯著高于二藥單用，同時(shí)抑制率隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，因此我們認(rèn)為地塞米松及奧沙利鉑聯(lián)合使用可以達(dá)到協(xié)同作用，同時(shí)這一結(jié)果又提示我們選擇地塞米松促進(jìn)機(jī)體對(duì)抗腫瘤藥物敏感時(shí)需要注意其使用劑量。

聯(lián)合治療本著增效減毒的目的，通過(guò)藥物與藥物、藥物與基因、藥物與蛋白等方式，以不同或相似的作用機(jī)制，在治療肺癌方面發(fā)揮著極大的作用。隨著深入研究，找出對(duì)肺癌具有治療或輔助治療作用的藥物聯(lián)用組合，對(duì)降低肺癌的致死率及轉(zhuǎn)移率，提高其治愈率、改善患者的生活質(zhì)量具有非常重要的意義。地塞米松能協(xié)同奧沙利鉑抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，達(dá)到一定劑量閾值時(shí)能顯著增強(qiáng)對(duì)腫瘤的抑制作用，為臨床治療肺癌的提供了科學(xué)依據(jù)和參考。

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