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多重PCR結(jié)合飛行質(zhì)譜技術(shù)檢測
40%非緩沖甲醛固定組織中的降解DNA

柳燕，李莉，林源，趙珍敏

（司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室，上海200063）

摘要：目的利用多重PCR結(jié)合飛行質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)檢測40 %非緩沖甲醛固定組織中降解DNA的SNP位點，提高微量降解檢材DNA的檢測時限，評估法醫(yī)學應用效能。方法提取保存在非緩沖40 %甲醛溶液中不同天數(shù)的人體組織DNA，用MALDI-TOF MS技術(shù)平臺檢測自行設(shè)計的67個X-SNP位點。STR和miniSTR位點的檢測時限評估用AmpFSTR identifiler和AmpFSTR MiniFiler試劑盒完成。結(jié)果40%非緩沖甲醛固定組織的STR和miniSTR位點檢測時限分別為7 d和15 d；用MALDI-TOF MS技術(shù)平臺檢測67個X-SNP位點，檢測片段均小于105bp，其中44個獨立遺傳X-SNP位點的檢測時限可達44d。結(jié)論MALDITOF MS技術(shù)平臺檢測X-SNP位點可明顯提高降解DNA樣本的檢測能力。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學；單核苷酸多態(tài)性；降解DNA；非緩沖甲醛固定液；聚合酶鏈反應；飛行質(zhì)譜技術(shù)

眾所周知，甲醛在空氣中逐漸被氧化呈現(xiàn)的酸性環(huán)境對DNA雙鏈有著極強烈的破壞性，40 %非緩沖甲醛固定組織中的DNA片段會隨著固定時間的延長而逐漸脆性增加被降解。DNA擴增片段長度逐漸下降，其降解程度直接影響法醫(yī)DNA的分型檢測成功率。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)是新近發(fā)展起來的一種簡單而高效的軟電離生物質(zhì)譜技術(shù)，其主要用途之一就是可以對基因的單核苷酸多態(tài)性進行分析。本文在多重PCR結(jié)合飛行質(zhì)譜技術(shù)平臺上，以X-SNP作為檢測標記，嘗試檢測超過STR檢測時限的40 %非緩沖甲醛固定組織，以期提高法醫(yī)實踐中極度降解DNA的檢測成功率。

1　材料與方法

1.1樣品和DNA提取

操作：在40 %甲醛溶液中固定保存了不同天數(shù)（4、7、15、37、44 d）的人體器官組織（心、腦、肝、脾、腎、肺、胃、腸），用蒸餾水淋洗干凈后，按QIAGEN公司“QIAamp DNA mini試劑盒”提取DNA。

1.2常染色體STR基因座分型

采用Identifiler和MiniFiler試劑盒在3100XL遺傳分析儀（美國AB公司）上對DNA提取液分別進行15個STR和9個miniSTR的片段分型檢測，觀察經(jīng)不同時間40 %非緩沖甲醛固定液固定后人體組織的可檢測STR基因座，分析DNA片段降解情況。

1.3 SNP位點的選擇

參考文獻按[1]合成67個X-SNP位點的引物并進行PCR擴增。

1.4 SNP分型

所有反應均在9700擴增儀（美國AB公司）上進行，以水代替模板作為陰性對照。

1.4.1多重復合PCR

67個SNP位點的目標序列分別由3個17重和1 個16重共計4組復合PCR反應完成。擴增體系為5 μL，包含10×PCR緩沖液0.625μL、2.5mmol/L dNTP 1μL、25mmol/L MgCl20.325μL、引物1μL、純水0.95μL、10 ng/μL DNA 1 μL、5 U/μL熱啟動Taq酶0.1 μL。PCR條件為94℃15 min；94℃20 s，56℃30 s，72℃1min，45次循環(huán)；72℃3min。

1.4.2蝦堿性磷酸酶反應

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶處理，去除多余dNTP。反應體系組成為：1 U/μL SAP 0.3μL、10×SAP緩沖液0.17μL、純水1.53μL，保溫37℃40min、85℃15min。

1.4.3單堿基引物延伸反應

單堿基引物延伸反應體積為2 μL，包含10×iPlex緩沖液0.2 μL，iPlex終止反應液0.1 μL，iPlex酶0.0205μL，純水0.7395μL，0.94μL延伸引物。反應程序為：94℃30s；52℃5s，80℃5s，5次循環(huán)；94℃5s，52℃5 s，80℃5 s，40次循環(huán)；72℃3 min。延伸產(chǎn)物用陽離子交換樹脂去鹽純化。

1.4.4基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜

用384微孔板（美國西格諾公司）的自動點樣器將待測樣品點至MassARRAY光譜檢測芯片上，推入檢測室進行檢測，檢測質(zhì)量范圍設(shè)定為3920～12023道爾頓，SNP位點的分型用MassARRAY TYPER分析軟件（version 4.0)完成。

2　結(jié)果

2.1 40 %非緩沖甲醛溶液中固定組織的STR檢測時限

在40 %甲醛溶液中固定7 d后，用AmpFSTR identifiler試劑盒檢測的常染色體STR開始降解而不能獲得完整圖譜信息；固定15d后，用MiniFiler kit檢測的mini STR開始降解而不能獲得完整圖譜信息。固定37~44d后，無法獲得有用的STR信息。

2.2 40%甲醛溶液中固定組織的SNP檢測時限40%非緩沖甲醛固定組織的SNP檢測時限隨著組織在固定劑中固定時間的延長，越來越多的SNP位點發(fā)生堿基的錯檢或漏檢。固定15 d后，1個位點（rs5926442）出現(xiàn)錯檢；固定37d后，4個位點（rs5926442，rs1229078，rs12840669，rs2214174）出現(xiàn)錯檢；固定44d后，12個位點出現(xiàn)錯檢（見表1）。

表1　發(fā)生錯誤分型的SNP位點在被檢測組織中的發(fā)生時間?。╠）

續(xù)表1

3　討論

非緩沖甲醛固定劑在室溫下極容易被氧化成甲酸，后者修飾和破壞人體組織DNA，導致DNA提取困難、脆性增加和斷裂降解及PCR抑制作用。隨著組織在福爾馬林液中固定時間的延長，其DNA擴增片段長度逐漸下降。因此組織在非緩沖福爾馬林中的固定時間是影響DNA檢測成功與否的關(guān)鍵因素。

AmpFSTR identifiler和AmpFSTR MiniFiler kit是美國AB公司研發(fā)的在使用比較普遍STR擴增檢測試劑盒，前者DNA擴增片段長度要達到350 bp，后者DNA擴增片段長度一般要達到250 bp。40 %非緩沖甲醛固定劑固定在4 d以內(nèi)的各種人體組織DNA片段長度均能達到350 bp以上，用AmpFSTR identifiler試劑盒可檢測到全部STR位點。超過4d后，對40%非緩沖甲醛固定劑抗性較差的肝、腸等組織DNA片段開始由長片段到小片段降解，固定9 d后，STR位點檢出率僅為50%[3]。在15d以內(nèi)的福爾馬林固定時間下，各種人體組織的DNA片段長度能達到200 bp以上，對降解檢材而言，此時的miniSTR檢測可以對常規(guī)STR檢測起到很好的補充作用。超過此檢測時限，miniSTR的檢測位點也發(fā)生信息大量丟失的情況。所以，要解決非緩沖福爾馬林固定組織中高度降解DNA的檢測成功率需要開發(fā)更多片段長度更短小的檢測系統(tǒng)。

本研究中采用的X-SNP分型技術(shù)平臺是多重PCR結(jié)合飛行質(zhì)譜技術(shù)，通過PCR擴增目標序列，然后加入SNP序列特異性單堿基延伸引物，獲得小于105 bp的DNA擴增片段，適合應用于超過miniSTR檢測時限、高度降解的小片段DNA分型檢測。在40%非緩沖甲醛固定劑中固定15 d后，所選擇的67個SNP位點，除rs5926442以外，均可得到正確分型結(jié)果，rs5926442位點從組織固定15 d后就在心、肝、脾、腎、腸樣品中發(fā)生了T堿基的漏檢，分型從雜合子CT被錯檢成C，該位點對樣品質(zhì)量的要求高于其他位點。其他位點對40 %非緩沖甲醛固定組織的正確分型力則隨著組織固定時間的延長有規(guī)律地減少。當固定時間超過37 d，可觀察到肝、腸組織又有3個位點（rs1229078，rs12840669、rs2214174）發(fā)生了錯檢或漏檢，至固定44 d，更多組織的其他9個位點發(fā)生錯檢或漏檢。綜合考慮67個X-SNP在漢族人群中的多態(tài)性分布、在X染色體上的連鎖程度以及各SNP位點在本檢測平臺上對高度降解DNA樣品質(zhì)量的耐受度等，最后確定1個44X-SNP檢測系統(tǒng)，其在男性群體和女性群體中的累積個體識別率、二聯(lián)體和三聯(lián)體的非父排除率均可達到法醫(yī)學實踐應用標準，對非緩沖福爾馬林固定人體組織的檢測時限從miniSTR的15d提高到44d。

[1]Li Li，Yan Liu，Yuan Lin. Typing of 67 SNP Loci on X Chromosome by PCR and MALDI-TOF MS[J]. Research in Genetics 2015，（10）：27-35.

[2]李莉，柳燕，林源，等. 67個X-SNP位點的分型檢測和連鎖不平衡檢驗[J].法醫(yī)學雜志，2011，27（5）：337-341.

[3]柳燕，李莉，趙珍敏，等.人體組織在非緩沖福爾馬林固定劑中的STR檢測時限[J].中國法醫(yī)學雜志，2010，25（1）：1-5.

（本文編輯：李成濤）

鑒定制度

Forensic System

X-SNP Typing of Degraded DNA from Formalin-fixed Tissues by MALDI-TOF MS

LIU Yan，LI Li，LIN Yuan，ZHAO Zhen-min

（Shanghai Key Laboratory of Forensic Science，Institute of Forensic Sciences，Ministry of Justice，Shanghai 200063，China）

Abstract:Objective To develop an applicable，high resolution X-SNP typing method for extremely degraded DNA from unbuffered formalin-fixed human tissues. Method Various tissues (heart，brain，liver，spleen，kidney，lung，stomach and intestine) obtained from autopsy were immersed in unbuffered formalin at room temperatures and sampled at regular intervals. DNA was extracted by the QIAamp kit，the primers were designed by the MassARRAY Assay Design software (Sequenom Inc.). Multiplex PCR was carried out in four amplification reactions and the related polymorphic sites were extended by the allelespecific primer and analyzed by the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF MS). Meanwhile，STR typing was also carried out by AmpFSTR identifiler and AmpFSTR MiniFiler. Results All the amplicons of 67 X -SNP loci were shorter than 105 bp. Among them，44 showed independent inheritance and high polymorphisms in Chinese Han population. The set of 44 X-SNP could be used to detect badly degraded DNA from tissues preserved in unbuffered formalin in up to 44 day. The combined discrimination power and the combined exclusion probabilities in both trio and duo case were more than 0.9999. STR and mini STR typing were not detectable in tissues that were preserved in unbuffered formalin for over 7 days and 15 days，respectively. Conclusion X-SNP typing with MALDITOF MS is a useful tool for detecting extremely degraded DNA which has shorter PCR amplicon. It can be applied in forensic personal identity and paternity test，especially in sister's kinship or grandmother-daughter's kinship cases in which alleged father is not available.

Key words:forensic genetics; single nucleotide polymorphisms; degraded DNA; unbuffered formalin; PCR; MALID-TOF.

作者簡介：柳燕（1963—），女，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學鑒定工作。E－mail：Liny@ssfjd.cn。

基金項目：上海市法醫(yī)學重點實驗室資助（14DZ2270800）

收稿日期：2015-06-20

文章編號：1671-2072-（2015）05-0041-03

doi:10.3969/j.issn.1671-2072.2015.05.007

文獻標志碼:A

中圖分類號：DF795.4