（武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院綠色化工過(guò)程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430074）

靈菌紅素（prodigiosin，PG）是一類(lèi)由細(xì)菌（如粘質(zhì)沙雷氏菌屬［1］、假單胞菌屬［2］）和放線菌（如鏈霉菌屬［3］）等微生物通過(guò)次級(jí)代謝途徑產(chǎn)生的天然紅色素，具有由3 個(gè)吡咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)［4］。PG 已被證實(shí)具備多種生物活性，如抗菌、抗瘧疾、抗原生動(dòng)物、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移抑制活性、免疫抑制和抗腫瘤活性等［4－9］。PG 最引人關(guān)注的是其引起癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制完全不同于當(dāng)前的臨床抗癌藥物，在一定濃度范圍內(nèi)，PG 可以選擇性作用于癌細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞毒性較小，是很有開(kāi)發(fā)潛力的抗腫瘤藥物［10－12］。粘質(zhì)沙雷氏菌是PG 最主要的產(chǎn)生菌［13］，天然PG 由于產(chǎn)量低而價(jià)格昂貴。目前國(guó)內(nèi)對(duì)PG 發(fā)酵過(guò)程的研究主要針對(duì)搖瓶培養(yǎng)過(guò)程，而對(duì)發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程研究甚少。

溶氧（dissolved oxygen，DO）對(duì)好氧微生物來(lái)說(shuō)既是重要的營(yíng)養(yǎng)成分，又是環(huán)境因素，溶氧很大程度上影響著細(xì)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)物的代謝［14］。根據(jù)微生物的生長(zhǎng)特性，發(fā)酵周期可分為調(diào)整期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。次級(jí)代謝產(chǎn)物一般在穩(wěn)定期大量合成，流加補(bǔ)料延長(zhǎng)穩(wěn)定期可以提高產(chǎn)物產(chǎn)量［15］。

作者在此以粘質(zhì)沙雷氏菌ZSG 為受試菌株，對(duì)PG 分批發(fā)酵過(guò)程的溶氧和補(bǔ)料方式進(jìn)行調(diào)控，研究恒溶氧控制下的PG 發(fā)酵過(guò)程，確定高產(chǎn)PG 分批發(fā)酵過(guò)程的最佳溶氧濃度；將溶氧濃度恒定在30%，通過(guò)流加補(bǔ)料并維持最適發(fā)酵pH 值，以期進(jìn)一步提高PG 產(chǎn)量，為工業(yè)化高產(chǎn)PG 提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與培養(yǎng)基

粘質(zhì)沙雷氏菌株ZSG，從糖化車(chē)間酸性土壤中篩選，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC No：M 209195）。

固體培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，瓊脂粉2%，NaCl 0.5%。

種子培養(yǎng)基：蔗糖0.5%，蛋白胨1.5%，NaCl 0.5%，MgCl20.25%，吐溫－80 1.0%。

分批發(fā)酵過(guò)程培養(yǎng)基同種子培養(yǎng)基。

1.2 試劑與儀器

靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品，自行分離提純；瓊脂粉、牛肉膏、蛋白胨均為國(guó)產(chǎn)生化試劑；其它藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BIOSTAT A plus型生物反應(yīng)器（德國(guó)貝朗5L發(fā)酵罐），賽多利斯；YXQ－LS－75S型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SPX－250B－D 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海卓爵儀器設(shè)備有限公司；TG18M 型高速離心機(jī)；UV－1800 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津；AIR TECH 型超凈工作臺(tái)；BS124S型分析天平。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將菌種活化后于固體培養(yǎng)基上劃線，29 ℃培養(yǎng)24h后接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于29℃、160r·min－1培養(yǎng)24h后，作為二級(jí)種子按10%的接種量接入發(fā)酵罐中。5L發(fā)酵罐中裝液量為3L，通氣量2.0vvm，培養(yǎng)溫度29 ℃，初始攪拌轉(zhuǎn)速200r·min－1，溶氧值用溶氧探頭實(shí)時(shí)監(jiān)控，手動(dòng)調(diào)控轉(zhuǎn)速維持恒定溶氧。

1.3.2 靈菌紅素的提取與純化

取粘質(zhì)沙雷氏菌ZSG 的發(fā)酵液，10 000r·min－1離心20 min，去上清，沉淀用酸性甲醇（pH＝3.0）溶解，超聲20 min 破碎菌體，離心，收集上清液，30～35 ℃下減壓蒸餾，濃縮液用乙酸乙酯溶解，4 ℃靜置過(guò)夜后冰浴析出雜質(zhì)。然后以體積比為5∶2的石油醚－丙酮為展開(kāi)劑，通過(guò)薄層層析法分離出紅色組分，即為PG 粗品。利用硅膠柱層析進(jìn)一步純化后減壓富集，得到PG 樣品，經(jīng)高效液相色譜測(cè)得純度高達(dá)98%，通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)特征吸收峰值為534 nm。

1.3.3 菌體干重的測(cè)定

取發(fā)酵液20mL裝入已知質(zhì)量的50mL 離心管中，10 000r·min－1離心20min，用蒸餾水洗滌后再離心，重復(fù)2次，余下的濕菌體置于80 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，測(cè)菌體干重（DCW）。再取3mL發(fā)酵液，蒸餾水洗滌菌體2次，生理鹽水稀釋菌體至30mL 后測(cè)600nm 處吸光度（OD600）。以菌體干重（x）為橫坐標(biāo)、OD600（y）為縱坐標(biāo)繪制菌體干重標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)菌體干重時(shí)，取發(fā)酵液測(cè)吸光度OD600，根據(jù)回歸方程計(jì)算菌體干重。

1.3.4 靈菌紅素產(chǎn)量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取純化的PG 粉末10mg，用酸性甲醇（pH值3.0）溶解并定容至20mL，得到0.5mg·mL－1的色素母液。準(zhǔn)確吸取色素母液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL，用酸性甲醇定容至10mL，測(cè)定534nm 處吸光度（OD534），以PG 濃度（x）為橫坐標(biāo)、OD534（y）為縱坐標(biāo)繪制PG 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)PG 產(chǎn)量時(shí)，取1mL 發(fā)酵液，酸性甲醇定容至10mL，超聲20 min破碎細(xì)胞，離心，收集上清液，測(cè)OD534，根據(jù)回歸方程計(jì)算發(fā)酵液中PG 濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌體干重標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）

由圖1可看出，OD600在0.1～1.0范圍內(nèi)與菌體干重呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝0.696x＋0.007，R2＝0.9961。

2.2 靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）

圖1 菌體干重標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of DCW

圖2 靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of PG

由圖2 可看出，OD534在0.1～1.0 范圍內(nèi)與PG濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝0.01022x＋0.01997，R2＝0.9972。

2.3 溶氧調(diào)控

粘質(zhì)沙雷氏菌屬于兼性厭氧菌，發(fā)酵過(guò)程中通入氧有利于生長(zhǎng)代謝，但細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的各個(gè)時(shí)期對(duì)氧的需求量是不同的，恒定轉(zhuǎn)速的溶氧控制方式容易造成發(fā)酵各階段溶氧濃度過(guò)高或過(guò)低，可能影響PG的產(chǎn)量。因此，有必要對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的溶氧濃度進(jìn)行調(diào)控，使PG 產(chǎn)量最大化?？疾炝撕愣ㄞD(zhuǎn)速為200r·min－1以及恒定溶氧分別為10%、30%、50%等4種溶氧控制下的分批發(fā)酵過(guò)程，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3a可看出：0～2h處于調(diào)整期，2～24h屬于對(duì)數(shù)期，24～54h是穩(wěn)定期，54h之后進(jìn)入衰亡期，表明該菌生長(zhǎng)速度極快，生長(zhǎng)周期較短；與恒定轉(zhuǎn)速相比，恒定溶氧更有利于菌體生長(zhǎng)，且溶氧濃度越高，生長(zhǎng)速度越快，菌體干重越高。由圖3b可看出：溶氧濃度為10%和30%時(shí)，PG 產(chǎn)量均比恒轉(zhuǎn)速時(shí)高；溶氧濃度為50%時(shí)，PG 產(chǎn)量最低，表明溶氧在一定濃度范圍內(nèi)提高了PG 產(chǎn)量，但并不是溶氧濃度越高PG 產(chǎn)量越高。

以恒轉(zhuǎn)速200r·min－1為對(duì)照組，分析不同溶氧控制下的發(fā)酵過(guò)程參數(shù)，如表1所示。

圖3 不同溶氧控制下，菌體干重（a）和靈菌紅素產(chǎn)量（b）與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系曲線Fig.3 Relationship curves of DCW（a）and PG production（b）with fermentation time under different DO controls

表1 不同溶氧控制下，靈菌紅素的發(fā)酵過(guò)程參數(shù)比較Tab.1 Comparison of parameters for PG batch fermentation under different DO controls

由表1可知：溶氧濃度為10%和30%時(shí)，菌體干重和PG 產(chǎn)量有所提高，尤其是當(dāng)溶氧濃度為30%時(shí)，PG 產(chǎn)量提高幅度最大，為69.0%；當(dāng)溶氧濃度為50%時(shí)，菌體干重提高幅度最大，為46.7%，但PG 產(chǎn)量反而下降了18.5%。表明溶氧濃度過(guò)低或過(guò)高都可能導(dǎo)致PG 產(chǎn)量下降。因此，確定恒定溶氧濃度為30%，此時(shí)PG 產(chǎn)量可達(dá)到最高。

2.4 補(bǔ)料調(diào)控

確定PG 合成最適pH 值：由于PG 主要在18～42h內(nèi)大量合成（圖3b），而在此期間pH 值由6.5上升到7.8（表2），表明PG 的合成是一個(gè)堿性增強(qiáng)的過(guò)程，當(dāng)pH 值超過(guò)7.8時(shí)，PG 合成緩慢，因此補(bǔ)料時(shí)pH 值應(yīng)控制在6.7～7.8。

表2 30%溶氧控制下，pH 值隨發(fā)酵時(shí)間的變化Tab.2 pH Value changes with fermentation time under 30% DO control

設(shè)計(jì)補(bǔ)料方案：45h時(shí)第一次流加0.5%的蔗糖和0.5%的吐溫－80；90h進(jìn)行第二次加倍補(bǔ)料。補(bǔ)料期間流加HCl維持發(fā)酵液pH 值在6.7～7.8，流加速度均控制在5mL·min－1，HCl濃度為3mol·L－1。

將發(fā)酵過(guò)程溶氧濃度控制在30%，在穩(wěn)定期流加補(bǔ)料，并維持發(fā)酵液pH 值為6.7～7.8，考察不同補(bǔ)料方式下菌體干重和PG 產(chǎn)量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖4，發(fā)酵過(guò)程參數(shù)見(jiàn)表3。

圖4 不同補(bǔ)料方式下，菌體干重和靈菌紅素產(chǎn)量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系Fig.4 Relationship curves of DCW and PG production with fermentation time under different feeding modes

表3 不同補(bǔ)料方式下，靈菌紅素的發(fā)酵過(guò)程參數(shù)比較Tab.3 Comparison of parameters for PG batch fermentation under different feeding modes

由圖4可看出：在穩(wěn)定期50h進(jìn)行第一次補(bǔ)料后菌體出現(xiàn)了二次生長(zhǎng)，PG 產(chǎn)量快速上升；90h時(shí)，PG合成再次停滯，此時(shí)進(jìn)行第二次補(bǔ)料，菌體干重和PG產(chǎn)量未見(jiàn)明顯上升。由表3也可以看到：第一次補(bǔ)料后，菌體干重和PG 產(chǎn)量分別增長(zhǎng)了34.3%和41.9%，增長(zhǎng)幅度較大，表明補(bǔ)料過(guò)程促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)；第二次補(bǔ)料菌體干重和PG 產(chǎn)量分別只增長(zhǎng)了6.2%和3.4%，PG 產(chǎn)量沒(méi)有明顯變化。這可能是培養(yǎng)體系中毒性物質(zhì)累積太多或者是體系中較高濃度的PG 產(chǎn)生了產(chǎn)物抑制，也可能是補(bǔ)料濃度過(guò)高，產(chǎn)生了底物抑制，導(dǎo)致PG 合成能力下降。經(jīng)過(guò)兩次補(bǔ)料調(diào)控后，菌體干重從1.08g·L－1提高到1.54g·L－1，PG 產(chǎn)量從79.01mg·L－1提高到115.98mg·L－1，與未補(bǔ)料相比，菌體干重提高了42.6%，PG產(chǎn)量提高了46.8%。

3 結(jié)論

以粘質(zhì)沙雷氏菌ZSG 為受試菌株，對(duì)靈菌紅素分批發(fā)酵過(guò)程的溶氧和補(bǔ)料方式進(jìn)行調(diào)控。分別以恒轉(zhuǎn)速（200r·min－1）與恒溶氧（10%、30%、50%）方式控制靈菌紅素分批發(fā)酵過(guò)程，結(jié)果表明，與恒轉(zhuǎn)速相比，恒溶氧控制方式能明顯提高菌體干重，且在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)了靈菌紅素的合成，在溶氧濃度為30%時(shí)，靈菌紅素產(chǎn)量可提高69.0%。將溶氧濃度恒定在30%、維持最適pH 值為6.7～7.8，通過(guò)流加補(bǔ)料可使靈菌紅素產(chǎn)量從補(bǔ)料前的79.01 mg·L－1提高到115.98mg·L－1，提高了46.8%。

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