鄧少穎，王道營，孫沖，張牧焓，卞歡，吳海虹，諸永志，耿志明，劉芳，徐為民

1(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京，210014)

2(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江蘇南京，210095)

豬肉的品質(zhì)是由一系列的評價指標(biāo)來評定，它包括食用品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)、技術(shù)品質(zhì)、衛(wèi)生品質(zhì)和安全性等［1］。而消費者對肉制品的評價往往是從感官評價開始的，其中嫩度和蒸煮損失是感官評價最為重要的2個方面［2-5］。肉的嫩度一般分為基礎(chǔ)硬度和肌動球蛋白硬度?；A(chǔ)硬度由結(jié)締組織蛋白和其他基質(zhì)蛋白決定，而肌動球蛋白硬度是由肌原纖維蛋白決定［6］，由于基礎(chǔ)硬度不易改變，因此改變肌原纖維蛋白中含量較高的肌動蛋白和肌球蛋白2種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是改善嫩度的有效途徑。

一磷酸腺苷(AMP)是脫氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)的組成成分，在生物體內(nèi)幾乎參與了所有的代謝過程，在細(xì)胞物質(zhì)能量代謝和功能調(diào)節(jié)中起重要作用［7］。AMP也被運用到食品加工中，作為增味劑或是其他某些特殊用途［8］。Okitani等研究加熱過程中嫩度的變化規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)嫩度相對較好時，有大量的肌動球蛋白發(fā)生解離［9］。Koohmaraie等推測宰后成熟過程中肌動球蛋白結(jié)構(gòu)的弱化可能對于肉品嫩度的改善起到了重要作用［10］。董晗等研究也發(fā)現(xiàn)，AMP能夠促進(jìn)鴨肉中肌動球蛋白的解離，并有較好的嫩度改善［11］。AMP在AMP脫氨酶(AMPD)的作用下，降解成肌苷酸(IMP)和氨［12］，進(jìn)而可能對肌動球蛋白的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)產(chǎn)生影響。而AMP脫氨酶的活性受到多種因素的影響，比如鹽，溫度等，因此對AMP脫氨酶產(chǎn)生影響的因素亦可能對剪切力及蒸煮損失產(chǎn)生影響。

本實驗擬研究AMP、鹽濃度、溫度對豬肉嫩度及蒸煮損失的影響，并利用響應(yīng)面優(yōu)化得到改善豬肉嫩度和蒸煮損失的最佳工藝參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

里脊肉，購自南京孝陵衛(wèi)農(nóng)貿(mào)市場，選自當(dāng)?shù)氐耐霖i品種，豬肉剛宰殺后，立即取里脊肉，置于4℃冰箱中成熟10 h，待用。

AMP，美國Sigma公司;NaCl(分析純)，巴傲得生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M124A電子分析天平，意大利BEL公司;SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊有限公司;CENTER 309型數(shù)顯溫度計，臺灣群特科技公司;HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司;TVT-300XP質(zhì)構(gòu)儀，瑞典波通儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肉樣處理

將選取的里脊肉修剪成形狀為(6×5×1.5)cm、質(zhì)量為(50±1)g的長方體肉塊。

1.3.2 剪切力測定

剪切力測定方法參照文獻(xiàn)［13-14］，稍作修改。測定整塊肉樣，每個樣品重復(fù)測定3次。使用TVT-300XP質(zhì)構(gòu)儀，安裝刀片式探頭(Razor-Blade Shear)，刀頭高為24.0 mm、寬為8.9 mm;參數(shù)設(shè)定如下:刺入深度為25 mm，觸發(fā)力為50 g，測試速度為2 mm/s。測試后得到最大剪切力。

1.3.3 蒸煮損失測定

里脊肉稱重后用蒸煮袋封好放入80℃水浴鍋中，加熱至肉中心溫度為75℃，立即取出，冰浴冷卻至肉中心溫度為20℃，取出樣品用濾紙吸干表面水分后稱重。

蒸煮損失/%=［(煮前重-煮后重)/煮前重］×100

1.3.4 單因素實驗

NaCl濃度對剪切力和蒸煮損失的影響:取18塊修剪好的里脊肉塊，隨機(jī)的分成6組，置于5號自封袋中，分別加入50 mL濃度為0%、2%、4%、6%、8%、10%的NaCl溶液(其中NaCl溶液中溶解有20 mmol/L的AMP)于5℃的生化培養(yǎng)箱中腌制10 h后，測定剪切力和蒸煮損失。

AMP濃度對剪切力和蒸煮損失的影響:取18塊修剪好的里脊肉塊，隨機(jī)的分成6組，置于5號自封袋中，分別加入 50 mL 濃度為 0、10、20、30、40、50 mmol/L的AMP溶液(AMP溶解于4%的NaCl溶液中)于5℃的生化培養(yǎng)箱中腌制10 h后，測定剪切力和蒸煮損失。

溫度對剪切力和蒸煮損失的影響:取15塊修剪好的里脊肉塊，隨機(jī)的分成5組，置于5號自封袋中，加入50 mL 20 mmol/L的AMP溶液(AMP溶解于4%的 NaCl溶液中)，分別于 5、10、15、20、25 ℃生化培養(yǎng)箱中腌制10 h后，測定剪切力和蒸煮損失。

1.3.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化改善豬肉嫩度及蒸煮損失的條件

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，結(jié)合Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗。以NaCl濃度(%)、AMP濃度(mmol/L)、溫度(℃)為自變量，以剪切力及蒸煮損失為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。其組合設(shè)計水平取值及編碼見表1。每個實驗進(jìn)行3次重復(fù)，實驗結(jié)果取平均值。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗重復(fù) 3次，所得數(shù)據(jù)采用 Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計和分析，用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。擬合二次多項式方程可以表達(dá)為:

式中Y是響應(yīng)值(剪切力、蒸煮損失);Xi、Xj為自變量編碼水平;b0為常數(shù)項;bi為線性回歸系數(shù);bii為二次項回歸系數(shù);bij為交互項回歸系數(shù)。多項式模型方程擬合可靠性由R2表達(dá)，其統(tǒng)計學(xué)上的顯著性由F值檢驗。影響因素的線性效應(yīng)、平方效應(yīng)及其交互效應(yīng)的顯著性由模型系數(shù)的P值、F值檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 NaCl濃度對剪切力和蒸煮損失的影響

由圖1可以看出，剪切力和蒸煮損失均隨著NaCl濃度的提高，先降低后升高，但兩者的變化趨勢不同。當(dāng)NaCl濃度從0% ～4%，剪切力顯著降低(P＜0.05)，再隨著NaCl濃度的升高，剪切力顯著升高，但6%，8%，10%處理組間無顯著性差異，與2%處理組也無顯著性差異(P＞0.05)。當(dāng)NaCl濃度從0%～4%，蒸煮損失顯著降低(P＜0.05)，再隨著NaCl濃度的升高，蒸煮損失顯著性升高(P＜0.05)。6%與8%NaCl濃度的處理組對蒸煮損失的影響無顯著性差異(P＞0.05)，8%與10%NaCl濃度的處理組對蒸煮損失的影響無顯著性差異(P＞0.05)。有研究表明，NaCl對AMP脫氨酶的活性會產(chǎn)生抑制性的影響［15］，因此可能有大量AMP未被降解，從而進(jìn)入到細(xì)胞中的AMP濃度相對較高，進(jìn)而作用于肌原纖維蛋白，使得嫩度得到改善。但隨著NaCl濃度的升高，肉的嫩度變差，可能是高濃度的鹽含量使得某些蛋白質(zhì)變性及水分含量減少。因此，綜合剪切力、蒸煮損失考慮，選取NaCl濃度為4%。

圖1 不同NaCl濃度對豬肉剪切力及蒸煮損失的影響Fig.1 Effect of NaCl concentration on shear force and cooking loss of pork

2.1.2 AMP濃度對剪切力和蒸煮損失的影響

由圖2可以看出，剪切力和蒸煮損失均隨著AMP濃度的提高而降低。AMP濃度從0～20 mmol/L，剪切力和蒸煮損失均顯著性降低(P＜0.05)，而后AMP濃度從20～40 mmol/L，剪切力降低不顯著(P＞0.05)，50 mmol AMP處理組除了與40 mmol/L處理組無顯著性差異外(P＞0.05)，與其他處理組都有顯著性差異(P＜0.05)。AMP濃度從30～50 mmol/L，蒸煮損失顯著性降低(P＜0.05)，而20 mmol/L與30 mmol/L處理組對蒸煮損失的影響無顯著性差異(P ＞0.05)。Okitani［16］等研究發(fā)現(xiàn)從雞、牛、豬骨骼中提取的肌動球蛋白溶液，經(jīng)AMP孵育后，肌動球蛋白發(fā)生了大量的解離。Koohmaraie［10］等推測宰后成熟過程中肌動球蛋白結(jié)構(gòu)的弱化可能對于肉品嫩度的改善起到了重要作用。因此，當(dāng)較高濃度的AMP進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，可能作用于肌動球蛋白使之發(fā)生解離，破壞了肌原纖維蛋白骨架的完整結(jié)構(gòu)，從而改善肉的嫩度。經(jīng)AMP處理后的豬肉有相對較高的pH值，并且AMP有助于抑制肌肉收縮，從而使得肌原纖維內(nèi)的水分含量增加。因此，綜合剪切力、蒸煮損失，及考慮到成本費用的增加，選取AMP濃度為20 mmol/L。

圖2 不同AMP濃度對豬肉剪切力及蒸煮損失的影響Fig.2 Effect of AMP concentration on shear force and cooking loss of pork

2.1.3 溫度對剪切力和蒸煮損失的影響

由圖3可以看出，剪切力和蒸煮損失均隨著溫度的升高，先降低后升高。不同溫度對剪切力和蒸煮損失都有相似的變化趨勢。溫度在5～15℃內(nèi)，剪切力和蒸煮損失均顯著性降低(P＜0.05);再隨著溫度的升高，剪切力和蒸煮損失均顯著性升高(P＜0.05)，但20和25℃處理組間的剪切力和蒸煮損失均無顯著性差異(P＞0.05)。隨著溫度的升高，有利于AMP進(jìn)入到細(xì)胞中發(fā)揮作用，但較高的溫度會促進(jìn)AMP脫氨酶的活性，可能使得AMP在未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時就降解成IMP，減弱AMP對肌原纖維蛋白的作用。因此，綜合剪切力、蒸煮損失考慮，選取溫度為15℃。

圖3 不同溫度對豬肉剪切力及蒸煮損失的影響Fig.3 Effect of temperature on shear force and cooking loss of pork

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面模型擬合及方差分析

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，確定NaCl濃度為4%、AMP濃度為20 mmol/L、溫度為15℃作為自變量，按照BBD方法設(shè)計實驗，以豬肉的剪切力和蒸煮損失作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗，得到的結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface methodology

利用Design Expert 8.0軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到以剪切力(Y1)和蒸煮損失(Y2)為目標(biāo)函數(shù)的二次多元回歸方程分別為:

對得到的回歸模型式(1)進(jìn)行方差分析，由表3可知，該模型的P＜0.000 1，表明該模型達(dá)到極顯著水平，又因其失擬項不顯著(P=0.735 5＞0.05)，表明該模型與數(shù)據(jù)得到很好的擬合，未知因素對本實驗的結(jié)果干擾很小［17-18］。模型的決定系數(shù)R2=0.997 8，說明該擬合模型方程與實際情況相符，能較好的反映NaCl濃度、AMP濃度和溫度與豬肉嫩度改善之間的關(guān)系［19-21］。采用F檢驗來判定回歸方程中各自變量對腌制后豬肉嫩度影響的顯著性，同時變量概率P值越小，其影響越顯著［22］。由表3回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，X1項、X2項、X1X2項、X12項、X22項、X32對響應(yīng)值有著極顯著的影響(P＜0.01)，X3項對響應(yīng)值有著顯著的影響(P＜0.05)，X1X3項、X2X3項對響應(yīng)值的影響不顯著(P＞0.05)。三因素對剪切力的影響順序為:X2＞X1＞X3，即 AMP濃度＞NaCl濃度＞溫度。

表3 回歸方程各項方差分析Table 3 Regression equation of the analysis of variance

對得到的回歸模型式(2)進(jìn)行方差分析，由表4可知，該模型的P＜0.000 1，表明該模型達(dá)到極顯著水平，又因其失擬項不顯著(P=0.621 6＞0.05)，表明該模型與數(shù)據(jù)得到很好的擬合，未知因素對本實驗的結(jié)果干擾很小。模型的決定系數(shù)R2=0.998 2，說明該擬合模型方程與實際情況相符，能較好的反映NaCl濃度、AMP濃度和溫度與蒸煮損失之間的關(guān)系。由表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，X1項、X2項、X3項、X1X2項、X12項、X22項、X32對響應(yīng)值有著極顯著的影響(P＜0.01)，X2X3項對響應(yīng)值有著顯著的影響(P＜0.05)，X1X3項對響應(yīng)值的影響不顯著(P＞0.05)。三因素對剪切力的影響順序為順序為:X2＞X1＞X3，即AMP濃度＞NaCl濃度＞溫度。

表4 回歸方程各項方差分析Table 4 Regression equation of the analysis of variance

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析與顯著因素最佳值的確定

圖4直觀地給出了NaCl濃度、AMP濃度、溫度之間交互作用對剪切力影響的響應(yīng)面3D和等高線圖。從圖4中的最低點和等值線可以看出，在所選的水平范圍內(nèi)存在極值，即為響應(yīng)面上的最低點，同時也是等高線圖中最小橢圓的中心點［23］。圖4-a是NaCl濃度和AMP濃度交互作用對剪切力影響的三維圖。當(dāng)溫度固定為15℃時，隨著AMP濃度的增加，剪切力值越來越小，曲面較陡;而隨著NaCl濃度的升高，剪切力先降低后升高。圖4-b NaCl濃度和AMP濃度交互作用的等高線圖呈橢圓形，表明兩因素有顯著的交互作用。表3也表明 NaCl濃度和AMP濃度及兩者之間交互作用對剪切力的變化有著極顯著的影響。圖4-c是NaCl濃度和溫度交互作用對剪切力影響的三維圖。當(dāng)AMP濃度固定為20 mmol時，隨著NaCl濃度和溫度的升高，剪切力先降低后升高，曲面呈鐘形。由圖4-d的等高線圖可知，NaCl濃度和溫度交互作用對剪切力影響不顯著，AMP濃度對剪切力有著極顯著的影響，與表3結(jié)論相同。圖4-e是AMP濃度和溫度交互作用對剪切力影響的三維圖。當(dāng)NaCl濃度固定為4%時，隨著AMP濃度的升高，剪切力降低較大，曲面較陡，而隨著溫度的升高，剪切力先降低后升高，變化趨勢較緩，曲面較平緩。由圖4-f的等高線圖可知，AMP濃度和溫度交互作用對剪切力影響不顯著。由SAS優(yōu)化程序分析剪切力相對較低時參數(shù)為NaCl濃度為4.15%，AMP濃度為 22.65 mmol/L，溫度為 16.70℃，剪切力可以達(dá)到621.769 g。

圖4 NaCl濃度、AMP濃度及溫度對豬肉剪切力影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of NaCl concentration，AMP concentration and temperature on shear force of pork

圖5直觀地給出了NaCl濃度、AMP濃度、溫度之間交互作用對蒸煮損失影響的響應(yīng)面3D和等高線圖。從圖5中的最低點和等值線可以看出，在所選的水平范圍內(nèi)存在極值，即為響應(yīng)面上的最低點，同時也是等高線圖中最小橢圓的中心點。圖5-a是NaCl濃度和AMP濃度交互作用對蒸煮損失影響的三維圖。當(dāng)溫度固定為15℃時，隨著AMP濃度的增加，蒸煮損失降低較大，曲面較陡;而隨著NaCl濃度的升高，蒸煮損失先降低后升高，曲面較陡。由圖5-b等高線圖可知NaCl濃度和AMP濃度交互作用對蒸煮損失有顯著的影響。而表3也表明，NaCl濃度和AMP濃度及兩者之間交互作用對蒸煮損失的變化有著極顯著的影響。圖5-c是NaCl濃度和溫度交互作用對蒸煮損失影響的三維圖。當(dāng)AMP濃度固定為20 mmol/L時，隨著NaCl濃度和溫度的升高，剪切力先降低后升高，但曲面變化較緩，曲面呈鐘形。由圖5-d的等高線圖可知NaCl濃度和溫度交互作用對蒸煮損失影響不顯著，AMP濃度對蒸煮損失有著極顯著影響，與表3結(jié)論相同。圖5-e是AMP濃度和溫度交互作用對蒸煮損失影響的三維圖。當(dāng)NaCl濃度固定為4%時，隨著AMP濃度的升高，蒸煮損失降低較快，曲面較陡，而隨著溫度的升高，剪切力先降低后升高，變化趨勢較大，曲面較陡。由圖5-f等高線圖可知，AMP濃度和溫度交互作用對蒸煮損失影響顯著。由SAS優(yōu)化程序分析蒸煮損失相對較低時參數(shù)為NaCl濃度為4.05%，AMP濃度為22.27 mmol/L，溫度為16.56℃，蒸煮損失可以達(dá)到7.801 86%。

圖5 NaCl濃度、AMP濃度及溫度對豬肉蒸煮損失影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of NaCl concentration，AMP concentration and temperature on cooking loss of pork

2.2.3 驗證實驗

根據(jù)剪切力和蒸煮損失最優(yōu)化的參數(shù)，結(jié)合實際操作與降低成本的考慮，選取的參數(shù)為:NaCl濃度4.15%，AMP濃度22.27 mmol/L，溫度16.70℃。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行3次驗證實驗，豬肉的剪切力的平均值為625.281 g，與理論預(yù)測值的相對誤差為0.562%;蒸煮損失的平均值為8.074 38%，與理論預(yù)測值的相對誤差為3.375%。說明應(yīng)用響應(yīng)面法對改善豬肉嫩度的參數(shù)優(yōu)化準(zhǔn)確可靠，具有實際可操作性。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對影響豬肉嫩度的因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，得到各因素對豬肉嫩度影響作用的關(guān)系為X2＞X1＞X3，即AMP濃度＞NaCl濃度＞溫度。得到的2個回歸模型極顯著，對實驗擬合程度較高，能夠較好地分析和預(yù)測各因素對豬肉腌制效果的影響。因此依據(jù)模型和實際操作確定最佳腌制條件為:NaCl濃度4.15%，AMP濃度22.27 mmol/L，溫度16.70℃，此條件下得到的剪切力為625.281 g，蒸煮損失為8.074 38%，與響應(yīng)面模型所預(yù)測的剪切力621.769 g及蒸煮損失7.801 86%十分接近，表明響應(yīng)面分析法優(yōu)化影響豬肉嫩度的條件是準(zhǔn)確可靠，具有較好的應(yīng)用價值。

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