范海燕，范文來，徐巖

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇無錫，214122)

豉香型白酒是廣東省有著悠久歷史的地方性傳統(tǒng)產(chǎn)品，具有“玉潔冰清、豉香獨(dú)特、醇和甘滑、余味爽凈”的特點(diǎn)［1］。豉香型白酒以大米為原料，蒸煮冷卻后加入適量水及20%～22%的大酒餅，在28℃左右液態(tài)下發(fā)酵約20 d后，蒸餾得乙醇體積分?jǐn)?shù)為31% ～32%的酒，俗稱齋酒。齋酒轉(zhuǎn)入多年浸泡酒肉的陳年肉缸，并加入經(jīng)加工的一定量肥豬肉浸泡30 d，經(jīng)過濾、勾兌后成為成品酒。其獨(dú)特之處:一是在大酒餅的生產(chǎn)中加入20% ～22%的黃豆;二是齋酒經(jīng)肥豬肉浸泡;三是液態(tài)發(fā)酵［1］。

1975年，廣東石灣酒廠［2］對豉香型白酒釀造用水、酒曲制造、燒酒釀制以及企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了描述，由此拉開了研究豉香型白酒的序幕。1995年，研究人員［3］應(yīng)用GC-MS技術(shù)檢測了豉香型白酒中的揮發(fā)性成分，定量了66種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酯類25種、醇類21種、酸類8種、羰基化合物9種、縮醛類3種。作者認(rèn)為2-苯乙醇、庚二酸二乙酯、辛二酸二乙酯、壬二酸二乙酯和3-甲硫基-1-丙醇是豉香型白酒的特征成分。眾所周知，2-苯乙醇呈玫瑰花或蜂蜜的氣味，3-甲硫基-1-丙醇呈煮土豆氣味［4］。庚二酸二乙酯、辛二酸二乙酯、壬二酸二乙酯沒有相關(guān)文獻(xiàn)記載其有呈香特征，作者也沒有對這些化合物進(jìn)行感官聞香鑒定。2010年，研究人員［5］應(yīng)用頂空固相微萃取(HSSPME)結(jié)合GC-MS技術(shù)定量了豉香型白酒中118種揮發(fā)性成分。到目前為止，大多數(shù)文章著重于豉香型白酒生產(chǎn)工藝的探討［1-2，6］和揮發(fā)性成分的檢測上［3，5］，而沒有使用風(fēng)味化學(xué)研究的方法如GC-O等研究其風(fēng)味成分。

近年來，GC-O技術(shù)已廣泛應(yīng)用于我國飲料酒的香氣成分分析中，如白酒［7-8］、黃酒［9-10］、蘋果酒［11］和葡萄［12］等。本研究以豉香型白酒為研究對象，采用液液萃取法分離濃縮風(fēng)味物質(zhì)，并按照酸堿性分成中-堿性組分和酸性-水溶性組分，通過GC-O和GCMS分析，確定豉香型白酒中的重要香氣化合物，為指導(dǎo)豉香型白酒的釀造、勾兌提供重要科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

豉香型白酒:由廣東省九江酒廠有限責(zé)任公司提供;鑒定中標(biāo)有 RI的化合物(表1):色譜純，購于Sigma-Aldrich(上海)公司;無水乙醚、NaSO4、NaCl:分析純，購于上海國藥集團(tuán);戊烷:色譜純，購于德國CNW公司。

Agilent GC 6890 N氣相色譜和5975 MSD質(zhì)譜儀，購于美國安捷倫公司;FFAP色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)、DC-12氮?dú)獯祾邇x，購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;ODP2聞香儀，購于德國Gerstel公司;超聲波清洗儀，購于天津 Autosciennce公司;Milli-Q超純水系統(tǒng)，購于美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液液萃取

根據(jù)Gao等人［7］的方法，取50 mL豉香型白酒酒樣，用煮沸并冷卻至室溫的超純水將酒樣稀釋至酒精度10%，加NaCl飽和。用20mL重蒸溶劑(乙醚∶戊烷=1∶1)在分液漏斗中重復(fù)萃取3次，然后合并有機(jī)相，再通過調(diào)節(jié)pH將萃出組分分成中-堿性組分和酸性-水溶性組分，加入適量Na2SO4于-20℃下干燥過夜，然后氮吹濃縮至200 μL，放置在-20℃下，待進(jìn)行GC-MS和GC-O分析。

1.2.2 GC-O分析

參考Gao等人［7］的方法，挑選2名經(jīng)過聞香訓(xùn)練的碩士研究生進(jìn)行聞香分析。應(yīng)用時(shí)間強(qiáng)度法，記錄香氣出現(xiàn)時(shí)間和香氣特征，香氣強(qiáng)度分為0～5六個(gè)等級。其中，“0”表示未聞到，“1”表示該化合物香氣強(qiáng)度很微弱，“3”表示香氣強(qiáng)度中等，“5”表示香氣強(qiáng)度非常強(qiáng)。每人對每個(gè)組分聞香3次，每個(gè)化合物的香氣強(qiáng)度為6次聞香結(jié)果的平均值。

1.2.3 GC-MS分析

色譜條件為:色譜柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm，J＆W Scientific)，進(jìn)樣口溫度為 250 ℃，以氦氣作為載氣，流速為2 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣，樣品隨著載氣一部分進(jìn)入MSD檢測器，另一部分進(jìn)入ODP2聞香儀。色譜柱升溫程序?yàn)?50℃保持2 min，然后以6℃/min的速率升至230℃，并保持10 min。聞香口的溫度設(shè)定為280℃。

質(zhì)譜條件:EI電離源;電子能量:70 eV;掃描范圍:35～350 amu;離子源溫度:230℃。

1.2.4 定性分析

根據(jù)改進(jìn)的Kovats法計(jì)算化合物的保留指數(shù)(RI):在各組分中添加C5～C30烷烴的混合標(biāo)樣，進(jìn)行GC-MS分析，根據(jù)烷烴的保留時(shí)間來計(jì)算化合物的RI［13］。通過質(zhì)譜譜庫檢索與NIST 05 a.L庫的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖比對定性。定性結(jié)果通過計(jì)算化合物的RI值、香氣描述與標(biāo)準(zhǔn)品的RI值和香氣描述比對確認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

應(yīng)用液液萃取法將豉香型白酒中的香氣化合物進(jìn)行分離濃縮，并根據(jù)酸堿性分為中-堿性組分和酸性-水溶性組分。通過GC-O聞香技術(shù)共檢測到52種香氣物質(zhì)，包括羰基化合物13種、酯類10種、酸類9種、芳香族類8種、醇類7種、硫化物2種、內(nèi)酯類2種和呋喃類1種。中-堿性組分和酸性-水溶性組分中分別檢測出43種、17種香氣物質(zhì)。

2.1 中-堿性組分

由圖1可以看出，中-堿性組分中檢測到的香氣化合物較多，主要包括羰基化合物、酯類、芳香族類和醇類化合物等。

圖1 豉香型白酒中-堿性組分(NBF，左圖)和酸性-水溶性組分(AF，右圖)在GC-MS上的總離子流圖及聞香強(qiáng)度圖Fig.1 The total ionic chromatography and aroma intensity of the aroma-active compounds in neutral-basic fraction(NBF，right)and acidic-water soluble fraction(AF，left)of chixiang aroma type liquor

根據(jù)香氣強(qiáng)度值，反-2-壬烯醛(香氣強(qiáng)度 =3.7)、反-2-辛烯醛(香氣強(qiáng)度=3.5)、辛醛(香氣強(qiáng)度=3.2)、反-2-癸烯醛(香氣強(qiáng)度=3.0)和壬醛(香氣強(qiáng)度=3.0)是豉香型白酒中重要的羰基化合物，均呈脂肪氣味。如表1所示，呈脂肪氣味的反-2-辛烯醛、反-2-壬烯醛、反-2-癸烯醛、反-2-十一烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛是在豉香型白酒中首次發(fā)現(xiàn)的化合物。不飽和醛類通常是啤酒的異嗅化合物［14-15］，也是烤豬肉的主要呈香化合物［16］。不飽和醛類由脂肪氧化而來［14，17］。豬肉中含有大量的脂肪［16］，可能會(huì)在豉香型白酒貯存的過程中氧化生成不飽和醛類。

表1 豉香型白酒中-堿性組分香氣化合物的聞香結(jié)果Table 1 Aroma-active compounds of chixiang aroma type liquor in neutral-basic fraction detected by Osme

在中-堿性組分中檢測到10種酯類化合物，主要呈水果香。己酸乙酯(香氣強(qiáng)度=3.0)是豉香型白酒中重要的酯類化合物。丁二酸二乙酯是聞到的唯一的二元酸二乙酯，呈花香;前人認(rèn)為的豉香型白酒的特征風(fēng)味成分庚二酸二乙酯、辛二酸二乙酯和壬二酸二乙酯［3］，應(yīng)用GC-O技術(shù)沒有檢測到。大多數(shù)酯類化合物由酸和醇在發(fā)酵和貯存過程中酯化而成［18］。

GC-O檢測到8種芳香族類化合物，2-苯乙醇香氣強(qiáng)度很高(香氣強(qiáng)度=4.2)，呈強(qiáng)烈的玫瑰花香，是豉香型白酒中重要的香氣物質(zhì)。L-苯丙氨酸是生成2-苯乙醇的主要前體，它在酵母發(fā)酵的過程中通過 Ehrlich 路徑生成 2-苯乙醇［19-20］。

在中-堿性組分中檢測到7種醇類，主要呈現(xiàn)水果香和花香。其中，3-甲基-1-丁醇具有較高的香氣強(qiáng)度(香氣強(qiáng)度=3.0)，呈指甲油氣味。醇類化合物主要來源于氨基酸和糖的降解［21］。

在豉香型白酒中檢測到2種硫化物，3-甲硫基1-丙醇和3-甲硫基1-丙醛，均呈煮土豆氣味。有研究認(rèn)為3-甲硫基-1-丙醇是豉香型白酒的特征風(fēng)味成分［3］，而在本研究中該化合物的香氣強(qiáng)度僅為1.0。另外，3-甲硫基-1-丙醇在豉香型白酒中的含量在0.2～2.0 mg/L 之間，平均含量為 0.7 mg/L［22］，低于其閾值 2 110.41 μg/L［23］，可以推測對豉香型白酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)很弱。根據(jù)香氣強(qiáng)度值，在豉香型白酒中新發(fā)現(xiàn)的3-甲硫基-1-丙醛(香氣強(qiáng)度=3.0)是其重要香氣化合物。

本實(shí)驗(yàn)檢測到2種內(nèi)酯類化合物，γ-辛內(nèi)酯和γ-壬內(nèi)酯，呈現(xiàn)甜香。其中，γ-壬內(nèi)酯香氣強(qiáng)度較大(香氣強(qiáng)度=3.3)，是豉香型白酒中重要的香氣化合物。

注a:MS，化合物通過質(zhì)譜檢測;aroma，化合物通過聞香確認(rèn);RI，標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù);RIFFAP，在FFAP極性柱上的保留指數(shù);RIL，參考文獻(xiàn)保留指數(shù)。

2.2 酸性-水溶性組分

由表2可知，豉香型白酒酸性-水溶性組分中的香氣化合物種類較少，主要有脂肪酸、醇類，以及少量的芳香族類化合物。根據(jù)香氣強(qiáng)度值(香氣強(qiáng)度≥3.0)，乙酸和丁酸是豉香型白酒重要的脂肪酸，分別呈醋酸和奶酪氣味。酸類化合物主要由發(fā)酵過程中的細(xì)菌產(chǎn)生［18］。

表2 豉香型白酒酸性-水溶性組分香氣化合物的聞香結(jié)果Table 2 Aroma-active compounds of chixiang aroma type liquor in acidic-water soluble fraction detected by Osme

醇類化合物除了在中堿性組分中檢測到外，在酸性-水溶性組分中也有檢測到，主要貢獻(xiàn)醇香和水果香。

在中-堿性組分和酸性-水溶性組分中均檢測到了2-苯乙醇，且香氣強(qiáng)度較大(≥3.0)，是豉香型白酒中重要的香氣化合物。

3 結(jié)論

本研究采用GC-O聞香技術(shù)研究豉香型白酒的風(fēng)味成分。應(yīng)用液液萃取法分離濃縮酒樣中的香氣化合物，并將化合物按酸堿性分離，然后聯(lián)用GC-O和GC-MS分析技術(shù)，更全面地詮釋樣品的信息。通過聞香分析檢測到豉香型白酒中52種香氣化合物。從化合物的種類和平均香氣強(qiáng)度來看，羰基化合物是豉香型白酒的重要香氣物質(zhì)。其中，呈脂肪氣味的反-2-辛烯醛、反-2-壬烯醛、反-2-癸烯醛、反-2-十一烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛是在豉香型白酒中首次發(fā)現(xiàn)的香氣化合物。研究發(fā)現(xiàn)豉香型白酒中香氣強(qiáng)度較大(≥3.0)的化合物有:2-苯乙醇、反-2-壬烯醛、己酸乙酯、反-2-辛烯醛、γ-壬內(nèi)酯、辛醛、3-甲基-1-丁醇、壬醛、3-甲硫基-1-丙醛、反-2-癸烯醛、乙酸和丁酸。接下來，筆者將對重要香氣化合物進(jìn)行定量分析，結(jié)合香氣活力值(OAV)，以及香氣物質(zhì)的重組缺失實(shí)驗(yàn)深入研究豉香型白酒的關(guān)鍵香氣。

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