毛曉婷，金尚忠，周鵬威，李敏超，唐海濤

1(中國計量學院光學與電子科技學院，浙江杭州，310018)2(華東理工大學生物工程學院，上海，200237)

3(北京美拓琪科技有限公司，北京，100088)

紅外光譜檢測方法是一種常用的化學分析方法，無論是對于已知物質化學結構的分析，還是對未知物的鑒定，紅外分析方法都顯示出其獨有的優(yōu)勢［1］。同時，隨著近年來紅外技術及儀器的發(fā)展，傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR)以其高精度、高分辨率等優(yōu)勢逐漸替代光柵型的紅外光譜儀。相比于近紅外光譜檢測方法，紅外光譜不僅檢測速度快，而且吸收峰與成分含量關系直接、數(shù)據(jù)分析和建模簡單［2］，檢測靈敏度和精度高，更適合于保健品、藥品等復雜成分合成的在線檢測［3］。配以衰減全內反射(Attenuated Total Reflectance，ATR)探頭，使得對于一些先前難以測試的物質(如紅外吸收過強的物質、粉末、糊狀樣品、纖維、微量液體等)的檢測成為可能［1］。

本文提出了一種保健品合成過程中，甲醇和甘油在線紅外監(jiān)測方案。應用FTIR光譜檢測技術結合多元數(shù)據(jù)分析方法，對所得的光譜數(shù)據(jù)進行建模，并將其應用到實際生產中。實驗數(shù)據(jù)顯示了反應過程中甲醇和甘油物質含量及變化趨勢，結果與實際生產過程中基本相符，甘油和甲醇從其加入反應釜到完全耗盡分別用時約40 h和6 h，為工業(yè)上生物反應過程中反應物的過程檢測提供一種可行方法。

1 ATR紅外光譜分析原理

當樣品受到頻率連續(xù)變化的紅外光照射時，分子吸收某些頻率的輻射，并由其振動運動或轉動運動引起偶極矩的變化，對于不同的分子結構，所產生的化學鍵的伸縮振動不同，從而出現(xiàn)明顯的吸收峰，因此根據(jù)甲醇和甘油特有的紅外吸收峰對其檢測。

中紅外光譜區(qū)吸收峰與成分含量關系直接。根據(jù)朗伯比爾(Lambert-Beer)定律［1］，當一束光通過樣品時，任意波長光的吸收強度(吸光度)與樣品中各組分的濃度成正比，與光程長(樣品厚度)成正比。對于非吸收性溶劑中單一溶質的紅外吸收光譜，在任一波數(shù)(υ，單位cm-1)處的吸光度為:

式中:A(υ)和T(υ)為波數(shù)υ處的紅外吸光度和透射率;α(υ)為υ處的吸收系數(shù);b為光程(樣品厚度，cm);c為樣品濃度(對液體物質，mol/L)［1］。

對N個組分的混合樣品，在波數(shù)υ處的總吸光度為:

實驗過程中只要測得多個波數(shù)位置的紅外吸光度，通過已建立的紅外模型就能反演獲得相應的參數(shù)測量。從式(1)中可見，物質在各波數(shù)處的吸光度值不同，因此測試波段的選擇決定實驗結果的準確度。

2 實驗方法

2.1 實驗材料

一定量的畢赤酵母菌培養(yǎng)液、適量的畢赤酵母菌種，甘油和甲醇分別為1 000 g和250 g。在適合該酵母菌生長的環(huán)境(由華東理工大學提供)下培養(yǎng)。

2.2 實驗裝置

2.2.1 ATR附件工作原理

衰減全內反射(ATR)光譜，以光輻射發(fā)生在2種介質界面的全內反射為基礎，如圖1所示。當滿足條件:介質1(晶體)的折射率n1大于介質2的折射率n2，當入射角θ大于臨界角θc(sinθc=n2/n1)時，發(fā)生全反射。紅外光在晶體內表面發(fā)生全反射時，在晶體的外表面附近產生隱失波。當樣品與晶體外表面接觸時，每個反射點隱失波都進入樣品。從隱失波衰減的能量可以得到吸收信息。常用的ATR探頭分為2種，一種是在晶體內部發(fā)生多次全內反射，另一種是單次全內反射ATR。多次全內反射ATR探頭靈敏度高，價格貴，體積大，對于紅外吸收較強的物質易引起飽和，本次實驗為防止出現(xiàn)紅外吸收過飽和現(xiàn)象，采用單次反射ATR探頭［5］。

圖1 ATR工作原理示意圖Fig.1 The scheme of the attenuated total reflection(ATR)

2.2.2 光纖連接裝置

紅外光譜檢測用特殊的硫化物紅外光纖(如圖2所示)來實現(xiàn)光譜儀器與反應釜的連接，硫化物對于紅外吸收區(qū)吸收較弱，同時由于光纖特有的柔軟性，使其與常見的光導管相比有更高的可操作性，外界的微震動或彎曲不會造成過高的實驗誤差，更適用于工業(yè)環(huán)境的實時檢測［6］。

圖2 光纖連接裝置實物圖Fig.2 Fiber optic connection device object

2.2.3 FTIR工作原理

FTIR光譜儀由3部分組成:紅外光源、干涉儀和探測器，其中干涉儀是最主要部分［7］。FTIR光譜儀工作時，從光源發(fā)出連續(xù)的紅外輻射經(jīng)分束器后被分為相等的兩束光，其中一束經(jīng)透射后到達動鏡M3，另一束經(jīng)反射到達定鏡M2。兩束光分別經(jīng)定鏡和動鏡反射再回到分束器發(fā)生干涉。由于動鏡以恒定速度作直線運動，因而產生的干涉圖是關于光程差的函數(shù)。通過樣品池含有樣品光信息的干涉光到達檢測器，檢測器測得的隨時間的信號，經(jīng)信號處理，通過傅里葉變換獲得隨波數(shù)(波長)的信號，最終得到透過率或吸光度隨波數(shù)(波長)的紅外吸收光譜圖［8］。相比于色散型的光譜儀，F(xiàn)TIR有更高的分辨率和靈敏度。

圖3 FTIR工作原理Fig.3 The scheme of FTIR spectrometer

2.2.4 實驗儀器

本實驗選用BRUKER FTIR(TENSOR27)光譜儀，分辨率為4 cm-1，波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，維持恒定的環(huán)境溫度和濕度，每個樣品掃描140次共1 min。光譜數(shù)據(jù)由相應的OPUS軟件進行分析。實驗裝置如圖4所示。

圖4 在線FT-IR監(jiān)測酵母菌發(fā)酵裝置圖Fig.4 System for the on-line FT-IR monitoring of yeast fermentation

光源發(fā)出紅外光通過光纖輸入端，入射到紅外ATR探頭，ATR探頭與反應釜密封相連。經(jīng)ATR探頭反射的紅外光通過光纖的輸出端進入碲鎘汞(MCT)探測器，探測器輸出的信號經(jīng)前置放大器、A/D變換，輸入到計算機，經(jīng)傅立葉變換得到紅外吸收光譜，通過OPUS軟件分析，從而獲得甘油(甲醇)的含量。值得注意的是，在實驗初期需要調整ATR附件反射鏡的角度，使其輸出到檢測器的能量達到最大，盡量減小損失，提高性噪比。

3 實驗數(shù)據(jù)分析

為實現(xiàn)在線監(jiān)測，本實驗借助外部光纖連接器件，將光譜儀與反應釜相連，改變傳統(tǒng)離線檢測方法。光纖連接器件采用專用的紅外傳輸光纖，相比于光導管，其柔韌性好，在工業(yè)應用中能夠在一定程度上減小外界震動引起光路變化損失的光強。在酵母菌培養(yǎng)過程中，甘油作為其發(fā)酵過程碳源，實時監(jiān)控甘油含量的變化，及時進行補料顯得尤為重要。同時在甲醇誘導蛋白表達的過程中，過高的甲醇含量會影響酵母菌的生長。所以，準確、快速監(jiān)測反應釜中甘油和甲醇含量，對于保證酵母菌較好的生長發(fā)揮重要的作用。

常用的兩種紅外光譜定量分析方法:一是測量吸收峰的峰高，另一種是測量吸收峰的峰面積。采用峰面積進行定量分析往往比采用峰高進行定量分析更加準確［7］。而在進行定量分析時，必須從測定的光譜中找出特征峰，求其峰面積從而進行定量分析［9］。

對于不同的培養(yǎng)基，甘油和甲醇的紅外吸收峰會發(fā)生微弱的變化，即使是相同的基底，在不同的濃度情況下紅外吸收峰也會不同(圖5)。

通過測量不同濃度情況下甘油和甲醇的畢赤酵母菌溶液，選擇出最合適的甘油和甲醇紅外積分區(qū)域1 060～1 025 cm-1和1 027～1 007 cm-1。從圖5中可以看出，對于不同濃度的甘油和甲醇酵母菌溶液，隨著濃度的增大，吸光度逐漸增加。

在過程檢測中，將某一時刻多次光譜掃描數(shù)據(jù)的均值作為該時刻甘油(甲醇)的預測值，然而在實際監(jiān)測過程中，可能由于反應釜攪拌棒的高速轉動產生氣泡，使得某次掃描紅外ATR探頭并未與反應物完全接觸，而是處于氣泡之中，這樣在所得的數(shù)據(jù)中會存在異常值。在建模初期應用格拉布斯統(tǒng)計方法剔除異常值，從而進行后續(xù)處理。為了檢驗所建模型在本次試驗條件下的準確度，首先用PLS建立的紅外模型對不同濃度下的甘油和甲醇酵母菌溶液進行檢測，實驗數(shù)據(jù)如圖6所示。

從圖6中可以看出，甘油和甲醇的紅外模型的預測相關系數(shù)分別達到0.985和0.998 7。

圖5 不同濃度的甘油(a)和甲醇(b)酵母菌溶液Fig.5 Different concentrations of glycerol and methanol solution of yeast

圖6 甘油(a)和甲醇(b)相關性特性曲線Fig.6 Glycerol and methanol correlation characteristic curve

目前作為一種離線檢測技術，F(xiàn)TIR光譜檢測得到廣泛的應用，大多應用在生物發(fā)酵過程中對光密度、生物量和各種反應物以及中間產物的監(jiān)測［4，6，10-14］。但是國內對于紅外在線的過程監(jiān)測，相關的研究文獻較少，還未成功的應用于實際生產。本實驗，應用BRUKER FTIR(TENSOR27)光譜儀外加紅外ATR附件對酵母菌培養(yǎng)過程中甘油和甲醇在線含量進行監(jiān)測。

實驗條件:反應釜中攪拌速率200 r/min，通氣流量20 L/min，壓力約0.3個大氣壓。

實驗結果如圖7所示。隨著時間的增加，甘油含量從最初4%逐漸下降到1.2%，之后趨于穩(wěn)定，這是因為隨著甘油含量的降低，其紅外吸收隨之減弱，超出儀器所能探測到的范圍。相比于離線紅外檢測的甘油檢出限1%，儀器在線監(jiān)測靈敏度相對較弱。在甘油完全耗盡之后，向反應釜中加入甲醇溶液刺激酵母菌的生長，圖7-b中，甲醇含量逐漸降低直至0.7%左右，同樣相比于離線甲醇檢測的檢出限0.5%，在線甲醇檢測的靈敏度低。同時在單位時間內甘油和甲醇的含量變化分別為0.107%和0.226%。

圖7 甘油(a)和甲醇(b)含量隨時間的變化趨勢Fig.7 Glycerol and methanol concentration varying trend with time going

圖7中，甲醇和甘油的含量并不是完全嚴格的線性減少，在某一測試點會出現(xiàn)數(shù)據(jù)陡然增大或減小。圖中實線為不同測試時刻多次測量的平均值，由于多次測量所處的反應狀態(tài)不同，會出現(xiàn)一定的誤差，但是從總體趨勢看，隨著時間的推移，甘油和甲醇的含量呈下降趨勢。除此之外，當甘油(甲醇)濃度過低時，將無法準確的檢出。目前，甘油和甲醇的離線檢出限分別為1%和0.5%，在線檢出限分別為1.2%和0.7%，更低濃度的測量結果不穩(wěn)定，有待提高。相比于高轉速(500 r/min)、短的掃描時間情況下，在低轉速(200 r/min)、掃描時間較長的條件下所測得的數(shù)據(jù)較穩(wěn)定［15］。

雖然在實驗過程中，由于釜體的振動，或通氣過程中釜體中氣泡的產生，以及其他因素的影響會引起數(shù)據(jù)監(jiān)測不穩(wěn)定。但從甘油和甲醇含量總體趨勢的變化，充分相信ATR-FTIR能夠用于過程監(jiān)測的可能性。

4 結論

紅外光譜分析技術，作為一種快速、無損檢測技術逐漸得到研究人員的關注［9］。在對酵母菌培養(yǎng)的過程中，應用ATR-FTIR對甘油和甲醇進行在線監(jiān)測，實驗結果表明:應用紅外光譜分析技術能夠成功的監(jiān)測畢赤酵母菌生長過程中甘油(甲醇)含量的變化情況，甘油和甲醇紅外模型相關度分別為0.985和0.998 7;培養(yǎng)開始40 h之后甘油耗盡，加入甲醇6 h之后其含量幾乎為0。實驗結果充分說明，紅外光譜分析技術在工業(yè)制藥行業(yè)在線監(jiān)測物質含量變化的可行性。同時，隨著紅外光譜儀器的快速發(fā)展，數(shù)據(jù)分析技術的提升，相信紅外光譜檢測技術在工業(yè)生產過程控制中將發(fā)揮重要作用［14］。

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