范勇，盧艷敏，崔波

(齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南，250353)

雙水相(aqueous two phase systems，ATPS)即2種不相溶的聚合物溶液或聚合物溶液與鹽相互混合達(dá)到一定臨界濃度時(shí)，形成互不相溶的兩相。雙水相系統(tǒng)主要有以下幾種類型:聚合物-聚合物，聚合物-鹽，離子液體-鹽，小分子醇-鹽和2種表面活性劑［1］。1956年，Albertsson等測定了多種雙水相的相圖及研究多種生物制品(如蛋白質(zhì)、核酸、病毒、細(xì)胞及細(xì)胞顆粒)在雙水相中的分配行為。其研究表明，ATPS法提取生物制品蘊(yùn)含巨大的應(yīng)用價(jià)值［2］。ATPS技術(shù)主要優(yōu)勢:ATPS含水量達(dá)70%～90%，能提供溫和的提取條件和環(huán)境，適于提取不穩(wěn)定的生物粒子;界面張力低，可提高傳質(zhì)速度;ATPS技術(shù)可連續(xù)化，集成化生產(chǎn)，減少單元操作過程。此外，ATPS技術(shù)優(yōu)勢還包括自然分相時(shí)間短，易于擴(kuò)大化生產(chǎn)，分配系數(shù)可控。ATPS已被廣泛應(yīng)用于多種生物制品的提取純化［3-4］。

1 雙水相法提取生物制品

ATPS提取生物制品可歸納為以下幾個(gè)方面:(1)提取蛋白質(zhì)、酶，ATPS提取蛋白質(zhì)的優(yōu)勢在于大大降低了破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可能性，保留其原有的活性;(2)提取遺傳物質(zhì)DNA;(3)提取具有高附加值的小分子物質(zhì);(4)提取細(xì)胞及細(xì)胞器。物質(zhì)的表面性質(zhì)、電荷作用、與疏水鍵的相互作用使目標(biāo)物與雜質(zhì)在上下相分配系數(shù)不同，可將目標(biāo)物與雜質(zhì)分離，如通過物質(zhì)的表面性質(zhì)(疏水性、親水性)將目標(biāo)物與雜質(zhì)(表面性質(zhì)與目標(biāo)物相反)分離。目前研究較多的是ATPS萃取目標(biāo)物的實(shí)驗(yàn)工藝條件，影響目標(biāo)物分配行為包括多種因素，如ATPS體系的組成成分及分子質(zhì)量、濃度或TLL，pH值，相比Vr，溫度，樣品添加量等，評價(jià)指標(biāo)包括提取率、分配系數(shù)K、純化因子等參數(shù)，綜合考慮以上影響因素及評價(jià)指標(biāo)可利用多種方法達(dá)到最佳提取條件。

1.1 雙水相法提取蛋白質(zhì)

ATPS提取的蛋白質(zhì)主要有酶、具有治療作用的抗體、捕光色蛋白質(zhì)如藻膽蛋白等。ATPS提取蛋白質(zhì)的優(yōu)勢在于大大降低了破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可能性，保留其原有的活性。關(guān)于ATPS提取分離蛋白質(zhì)的研究應(yīng)用已有諸多報(bào)導(dǎo)。

Rados?aw Dembczyn'ski等［5］用環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物(EO50PO50)-K2HPO4體系從蛋清中提取溶菌酶，實(shí)驗(yàn)采用了3種不同濃度的體系，綜合考慮分配系數(shù)和提取率，采用體系B(3.3%EO50PO50，13.3%K2HPO4，pH=7，0.85 mol/L NaCl，樣品添加量為稀釋3倍的7 mL蛋白)。由于EO50PO50的濁點(diǎn)較低，將富含EO50PO50的上相提取出來再經(jīng)過加熱(高于其濁點(diǎn))使其形成兩相，溶菌酶分配在富含水的上相，實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)過2次ATPS提取后提取率、純化因子和酶活分別為85%，16.9，32，300 U/mg。應(yīng)用溫度誘導(dǎo)分離型聚合物的ATPS提取溶菌酶有利于相成分的循環(huán)再利用，可降低生產(chǎn)成本。Aguilar等［6］用聚乙二醇(PEG)-磷酸鉀鹽ATPS提取由大腸桿菌重組菌生產(chǎn)的青霉素?；?，實(shí)驗(yàn)表明最優(yōu)參數(shù)為PEG 1 450 g/mol，系線 TLL 48.5%，相比 Vr=1.0，pH=7，樣品添加量35%時(shí)，上相純化因子和提取率達(dá)分別為3，97%。此外，將ATPS法與色譜法提取青霉素酰化酶的實(shí)驗(yàn)成本進(jìn)行比較，ATPS法的花費(fèi)減少了37%。成本降低是由于操作單元的減少。因此證明ATPS法適于提取青霉素酰化酶及具有規(guī)?；a(chǎn)的前景。

關(guān)于ATPS法提取具有治療作用的蛋白質(zhì)已有廣泛研究報(bào)導(dǎo)。Platis等［7］研究采用PEG-磷酸鉀鹽ATPS提取在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)的HIV單克隆抗體2F5(mAb2F5)，在最優(yōu)條件下PEG 1 500 g/mol 12%，K3PO413%，pH=5，提取率和純化因子分別為95%，3～4。Rosa等［8］用含有化學(xué)改性 PEG 的ATPS提取由中國倉鼠卵巢細(xì)胞生產(chǎn)的人體免疫球蛋白gamma(IgG)，在血清中，IgG是含量最多的免疫球蛋白，其具有重要的免疫作用。實(shí)驗(yàn)表明，用含有150 g/mol PEG-COOH的PEG-葡聚糖(簡寫Dex)體系提取IgG，IgG的純化因子和提取率分別為1.9，93%。ATPS中添加化學(xué)物質(zhì)如修飾的聚合物、金屬離子、極性溶劑等可提高目標(biāo)物的選擇性，提高目標(biāo)物的產(chǎn)率和純度。目前，國內(nèi)外已開展了應(yīng)用親和雙水相(聚合物上耦聯(lián)特定的親和配基)提取蛋白質(zhì)的研究，表1為近年來應(yīng)用親和雙水相提取蛋白質(zhì)的實(shí)例。

表1 親和雙水相法提取蛋白質(zhì)的實(shí)例Table 1 some examples of aqueous two-phase affinity partitioning systems for recovery and purification of proteins

由于人們越來越重視合成色素對人體健康的危害，所以在食品和化妝品行業(yè)中關(guān)于提取純化有色化合物的研究越來越多。某些天然有色化合物在分子技術(shù)領(lǐng)域中可以作為熒光標(biāo)記。存在于藻類和藍(lán)細(xì)菌中的藻膽蛋白是一種重要的捕光色蛋白，這種蛋白可作為天然色素使用。Benavides［17］等用 PEG-磷酸鉀體系從紫球藻中提取純化B-藻紅蛋白(BPE)，實(shí)驗(yàn)表明，最優(yōu)條件為PEG1000 g/mol(29%)-磷酸鉀鹽(9%)，TLL 45%，Vr=4.5，pH=7，提取率和純化因子分別達(dá) 90%，4。Chethana等［18］用 PEG-磷酸鉀鹽從鈍頂螺旋藻中提取C-藻藍(lán)蛋白(CPC)，C-藻藍(lán)蛋白富集在PEG上相，實(shí)驗(yàn)研究了PEG分子質(zhì)量、系線TLL、體積比Vr、PEG濃度、鹽濃度對CPC分配行為的影響。PEG 1500分配系數(shù)K隨TLL的增加而增加，但純度降低，PEG 4000，6000 ATPS中的CPC的分配行為與體系PEG 1500相似。同樣考查了3種不同Vr(0.22，0.54，1.25)對CPC分配行為影響，Vr=0.22，CPC純化因子最大達(dá)3.4，但提取率僅為40%(PEG 4000/磷酸鹽TLL14%)。實(shí)驗(yàn)條件在pH 7.0，PEG4000 6%，磷酸鹽 15%，Vr 0.25，純化因子和提取率達(dá)4.32，79%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此ATPS適于提取鈍頂螺旋藻中的CPC。

1.2 雙水相法提取遺傳物質(zhì)

關(guān)于ATPS法提取純化遺傳物質(zhì)的研究已有報(bào)道，如質(zhì)粒 DNA 載體。Trindade 等［19］用 PEG-(NH4)2SO4體系提取質(zhì)粒DNA(pDNA)載體。實(shí)驗(yàn)從大腸桿菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物中提取質(zhì)粒DNA載體，體系條件為PEG 600 34%，(NH4)2SO46%，Vr=9.3樣品添加量20%，pDNA完全分配在下相，提取率達(dá)100%，pDNA濃縮了3倍。為了實(shí)現(xiàn)工藝過程強(qiáng)化，樣品添加量從20%提高到40%，樣品添加量40%為時(shí)，提取率達(dá)為85%，pDNA濃縮了8倍。

Duarte等［20］用ATPS法提取pDNA與聚合物相連的一種復(fù)合物，此種復(fù)合物是一種可用于基因治療的基因載體。采用2種ATPS體系(600 g/mol PEG-(NH4)2SO4和350 g/mol PEG-Dextran 110)連續(xù)進(jìn)行提取，將聚乙二醇化聚乙烯亞胺(pPEI)添加到第二階段的ATPS體系中，pPEI作為親和配體可與目標(biāo)物定向結(jié)合，可提高雙水相對目標(biāo)物的選擇性。經(jīng)過2種ATPS萃取后RNA和雜蛋白被完全分離去除，目標(biāo)復(fù)合物的提取率達(dá)到100%，雖然用超濾膜將目標(biāo)物與PEG和Dextran分離時(shí)會(huì)使目標(biāo)物產(chǎn)率損失5%～10%。但實(shí)驗(yàn)證明了親和雙水相對于質(zhì)粒復(fù)合物的提取具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

Matos等［21］用2次ATPS從PCR中提取小片段DNA，首先用PEG4000-聚丙烯酸鹽24000ATPS提取DNA，PCR分配在富含 PEG的上相，再將上相與Na2SO4組成雙水相，DNA分配在富含Na2SO4的下相，蛋白質(zhì)和大分子DNA被除去，小片段DNA(小于4000 bp)的提取率達(dá)95%。

1.3 雙水相法提取小分子物質(zhì)

近年來，具有高附加值的小分子物質(zhì)成為研究熱點(diǎn)，應(yīng)用ATPS法提取小分子物質(zhì)的研究也逐漸增加。Zhi jian Tan等［22］用ATPS法從蘆薈中提取具有抗氧化作用和藥用價(jià)值的蒽醌類化合物(AQs)，實(shí)驗(yàn)考查了不同小分子醇與(NH4)2SO4組成的雙水相提取AQs，結(jié)果表明采用正丙醇-(NH4)2SO4體系提取率最高，條件為 25℃下，正丙醇 17.84%，(NH4)2SO426.66%，AQs的最高提取率達(dá)95.56%。

Peretra 等［23］用PEG-聚丙烯酸鈉(NaPA)-Na2SO4提取克拉維酸，實(shí)驗(yàn)首先考查聚合物PEG(2000，4000，6000)和聚丙烯酸鈉對克拉維酸的影響，結(jié)果表明2種聚合物對其沒有降解。研究NaCl和Na2SO4對克拉維酸分配系數(shù) K的影響，添加Na2SO4體系的K值高于添加NaCl的，與NaCl相比Na2SO4對克拉維酸分配在富含PEG上相的作用更強(qiáng)。體系條件為 PEG4000 10%，NaPA8000 20%，Na2SO46%，K值為9.15。此體系中克拉維酸的K值高于PEG-磷酸鉀ATPS(K=8.2)，證明這種ATPS體系適合克拉維酸的初步純化。

孫晨等［24］采用脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO-7)-NNa3PO4·12H2O雙水相提取L-苯丙氨酸，實(shí)驗(yàn)考察了不同鹽(NaCl、Na2SO4、NNa3PO4)、AEO-7 含量、提取時(shí)間、加入L-苯丙氨酸的含量和溫度對L-苯丙氨酸提取率和分配系數(shù)的影響，當(dāng)條件為AEO-7的體積濃度為8%，NNa3PO4·12H2O的質(zhì)量濃度為85 g/L，溫度40℃，L-苯丙氨酸的質(zhì)量濃度為0.532 8 g/L，提取時(shí)間60 min，L-苯丙氨酸的提取率和分配系數(shù)分別為98.7%，15.3，實(shí)驗(yàn)表明AEO-7 /NNa3PO4ATPS適于提取L-苯丙氨酸

1.4 雙水相法提取細(xì)胞及細(xì)胞器

ATPS法提取細(xì)胞，主要應(yīng)用包括細(xì)胞分選、細(xì)胞器的分離。熊霞等［25］采用ATPS純化大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜，差速離心后得到的質(zhì)膜濃度提高了2.3倍。Edahiro［26］采用PEG-Dex提取花青素含量較高的草莓細(xì)胞，花青素含量差異大的細(xì)胞被分開，分成2個(gè)細(xì)胞群。ATPS中添加1.8 mmol/kg磷酸鉀緩沖液，培養(yǎng)10 d花青素含量高的草莓細(xì)胞完全分配在下相。Morre等［27］采用ATPS法從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取質(zhì)膜和高爾基體，質(zhì)膜純度達(dá)85%，離心后下相高爾基體濃縮了3.5倍。與上相的親和力由小到大依次為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體、溶菌酶和核內(nèi)體、質(zhì)膜。ATPS法適于提取細(xì)胞及細(xì)胞器。

2 雙水相與其他其他新技術(shù)的集成

為更高效的提取分離目標(biāo)物，采用ATPS與其他新技術(shù)集成。主要包括:(1)與雙向電泳技術(shù)結(jié)合，主要應(yīng)用與蛋白質(zhì)提取方面以得到相關(guān)信息;(2)與微流控制技術(shù)相結(jié)合，通過流體動(dòng)力學(xué)提高傳質(zhì)速率來提高提取分離效果;(3)與高速逆流色譜技術(shù)結(jié)合，有效的將ATPS萃取技術(shù)與色譜分離結(jié)合在一起，高效的提取純化目標(biāo)物質(zhì);(4)雙水相與溫度誘導(dǎo)相分離、磁場作用、超聲波作用、氣溶膠技術(shù)等常規(guī)技術(shù)實(shí)現(xiàn)集成化，改善了雙水相萃取技術(shù)中的一些問題，如成相聚合物回收困難、相分離時(shí)間較長、易乳化等。

2.1 雙水相與雙向電泳技術(shù)結(jié)合

ATPS與雙向電泳(2-DE)技術(shù)結(jié)合主要應(yīng)用與蛋白質(zhì)提取方面，通過雙向電泳圖譜得到蛋白質(zhì)的一些相關(guān)信息如分子質(zhì)量、等電點(diǎn)(pI)、表達(dá)水平。雙向電泳具有簡便、快速、高分辨率和重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，克服了SDS-PAGE的一些不足，如SDS-PAGE很難檢測到低豐度蛋白，聚合蛋白質(zhì)，疏水蛋白。Gu和Glatz［28］將雙水相PEG3350(15.7%)Na2SO4(8.9%)-NaCl(3%)與雙向電泳結(jié)合得到蛋白質(zhì)特性的3D圖，包括等電點(diǎn)pI、分子質(zhì)量MW和表面疏水性SH。得到玉米胚芽蛋白的3D圖，與pH=7的玉米胚芽提取物相比，pH=4時(shí)提取物蛋白質(zhì)較少、疏水性強(qiáng)、分子量小。

2.2 微流控制與雙水相技術(shù)結(jié)合

微流控制分離通過改變幾何形狀來影響兩相間的流動(dòng)模式和界面形狀，從而提高界面間的傳質(zhì)速率和目標(biāo)物的提取率。近年來，微流控制技術(shù)與ATPS結(jié)合的研究已受到關(guān)注。黃宇石等［29］用 PEG-(NH4)2SO4體系提取糖化酶，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了提取分離的微流控裝置，研究了微通道內(nèi)的雷諾層流條件，并將了微流控和燒杯中的ATPS(PEG24%，(NH4)2SO420%，Vr=1，糖化酶酶粉0.03g)溶液進(jìn)行了對比實(shí)驗(yàn)，微流控萃取的傳質(zhì)速率是燒杯中的2.8倍，微通道和燒杯中單位雙水相體積單位時(shí)間的傳質(zhì)量分別為127.15，2.96 g/cm3·s，前者是后者的 42 倍，微流控制與ATPS技術(shù)相結(jié)合，提供了兩相較快的環(huán)隙流動(dòng)速度和較大的傳質(zhì)比表面積，微流控雙水相萃取效果遠(yuǎn)優(yōu)于普通燒杯中萃取。

SooHoo［30］將 ATPSPEG-葡聚糖(簡寫 Dex)與微流控制結(jié)合從全血中提取白血球，實(shí)驗(yàn)根據(jù)微流裝置的層流流動(dòng)特點(diǎn)，考查聚合物間無穩(wěn)定界面(不相融的PEG-PEG-Dex)，一個(gè)穩(wěn)定界面(不相融的 Dex-PEG-Dex)，2個(gè)穩(wěn)定界面(PEG-PBS(磷酸鹽緩沖液)-Dex)3種萃取情況，結(jié)果表明提取效果最好的配置是Dex-PEG-Dex，其白細(xì)胞與紅細(xì)胞之比是樣品的9.13倍。

Meagher等［31］應(yīng)用微流控制雙水相法，結(jié)果表明可除去約85%的雜蛋白。Yushi Huang［32］等用微流控制雙水相法提取牛血清蛋白，3個(gè)周期提取僅用3.6s，牛血清蛋白提取率達(dá)71%，結(jié)果優(yōu)于普通雙水相。

2.3 高速逆流色譜與雙水相結(jié)合

郅文波等［33］采用高速逆流色譜與 PEG1000-磷酸鉀鹽ATPS相結(jié)合對標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物以及卵白蛋白進(jìn)行分離，結(jié)果表明 PEG1000 15%，K3PO4鹽17%，pH 9.2，高速逆流色譜流速0.8 mL/min，轉(zhuǎn)速850 r/min，成功分離細(xì)胞色素C、溶菌酶和肌紅蛋白的混合物，PEG1000 16%，K3PO417%，pH 9.2，高速逆流色譜流速1.8 mL/min，轉(zhuǎn)速850 r/min，200 min內(nèi)從雞蛋蛋清樣品中分離卵白蛋白，其電泳純度為100%，收率達(dá)95%。

Liu等［34］將高速逆流色譜與 ATPS乙醇-(NH4)2SO4相結(jié)合成功分離4種核苷，雙水相條件為乙醇27%，(NH4)2SO421%，高速逆流色譜以上相作為流動(dòng)相，流動(dòng)方向從頭到尾，流速0.7 mL/min，轉(zhuǎn)速800 r/min，分離了4種核苷腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷。

2.4 雙水相與其他技術(shù)相結(jié)合

Lopes等［35］采用溫度誘導(dǎo)雙水相體系從大腸桿菌發(fā)酵液中提取綠色熒光蛋白和除去內(nèi)毒素，結(jié)果表明，綠色熒光蛋白的提取率達(dá)96%且除去了99%的內(nèi)毒素。翟素玲等［36］采用雙水相電泳(PEG-Dex)分離氨基酸，結(jié)果表明，ATPS萃取過程中外加電場使苯丙氨酸和色氨酸的分離效果有明顯的提高，延長分離時(shí)間或提高電場強(qiáng)度使苯丙氨酸萃取率達(dá)到90%以上，基本實(shí)現(xiàn)完全分離。Save等［37］將ATPS萃取與氣溶膠技術(shù)結(jié)合，實(shí)驗(yàn)考察了淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶的傳質(zhì)性能，傳質(zhì)系數(shù) K高于噴射床，表明ATPS萃取結(jié)合氣溶膠技術(shù)有效提高了萃取柱的傳質(zhì)性能。

3 雙水相技術(shù)面臨的問題及展望

ATPS萃取技術(shù)克服了有機(jī)溶劑使生物粒子變性作用，其操作條件溫和適于提取生物制品。對于蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)、小分子物質(zhì)、細(xì)胞、細(xì)胞器的提取分離已有許多的研究，但雙水相萃取技術(shù)還面臨很多問題:(1)對于ATPS機(jī)理研究還不夠成熟，需進(jìn)一步的深入研究。ATPS組分間作用比較復(fù)雜，目標(biāo)物的分配行為受表面性質(zhì)、電荷作用與其他作用力的影響。關(guān)于物質(zhì)在ATPS體系間的分配行為的研究比較少，缺乏理論或模型解釋;(2)ATPS萃取生物制品雖具有粗分離的作用，但同時(shí)也引入成相物質(zhì)且目標(biāo)物與成相物質(zhì)難于分離，對后續(xù)分離工藝不利，分離過程產(chǎn)生的成相物質(zhì)的溶液難于回收利用;(3)ATPS萃取的研究多數(shù)建立在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，缺乏對于相際間傳質(zhì)傳遞的動(dòng)力學(xué)研究。所以作為一種重要的提取純化的技術(shù)方法ATPS萃取應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)還面臨諸多問題。

目前，在生物制藥業(yè)中，下游加工過程的費(fèi)用占總成本的40%～70%，因此，關(guān)于降低ATPS生產(chǎn)成本的研究也不斷增加。降低ATPS生產(chǎn)成本的方法主要有:(1)降低ATPS組成成分的成本，開發(fā)廉價(jià)ATPS體系;(2)ATPS相成分循環(huán)再利用。Ghosh等［38］用廉價(jià)的 DexT40代替昂貴的 DexT50，用變性淀粉、乙基羥乙基纖維素等代替昂貴的葡聚糖，用羥基纖維素、聚乙烯醇等代替PEG，可制成廉價(jià)的ATPS體系。Dembczyński等［39］用 EO50PO50-K2HPO4溫度誘導(dǎo) ATPS體系提取溶菌酶，研究了相成分EO50PO50和K2HPO4的循環(huán)再利用提取溶菌酶。但ATPS萃取生物制品仍有巨大潛在的價(jià)值，研究人員也在不斷探索以解決以上所面臨的問題。

ATPS萃取技術(shù)未來發(fā)展的方向主要包括2個(gè)方面:(1)所有理論研究不能脫離實(shí)際應(yīng)用，ATPS萃取技術(shù)的發(fā)展應(yīng)適于大規(guī)模的工廠生產(chǎn)，要相對容易建立投產(chǎn)這就離不開技術(shù)集成化和提高ATPS萃取技術(shù)本身的優(yōu)勢，在萃取的同時(shí)達(dá)到分離以節(jié)省后續(xù)分離的麻煩，使其在應(yīng)用中可減少成本的投入;(2)同時(shí)生產(chǎn)應(yīng)用離不開理論基礎(chǔ)研究，ATPS萃取技術(shù)所面臨的問題正是理論研究亟待解決的，ATPS體系熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)機(jī)理研究的不斷深入也是此技術(shù)未來發(fā)展的一大挑戰(zhàn)。

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