張麗娟，閆靜芳，樂田，顏智勇，張生生，，陳陽陽，武奔月，王昱灃

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)2(江蘇聯(lián)益生物科技有限公司，江蘇盱眙，211700)

珍稀食藥用菌長根菇(Collybia radicata)又名長根奧德蘑(Oudemansiella radicata)、長根金錢菌、長壽菇、“雞肉絲菇”，隸屬于真菌門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、奧德蘑屬，是人們?nèi)粘Ｏ矏鄣纳系染愂称贰８缓鞍踪|(zhì)、氨基酸［1］、碳水化合物、維生素、微量元素等成分，肉嫩味鮮［2］，素有“草雞樅”、“露水雞樅”之稱，在國際市場上被譽為“食用菌皇后”［3］。長根菇子實體和發(fā)酵液中含有長根素，有降低血壓的功效［4-5］。長根菇多糖是長根菇的重要活性成分，具有抗氧化作用［6］。國內(nèi)外對長根菇的研究主要集中在菌絲體培養(yǎng)［7-10］、深層發(fā)酵［11-13］、馴化栽培［14-15］和氨基酸分析［16］等方面，而有關(guān)長根菇多糖提取分離方面只有少量報道［17-18］。田龍等［17］采用熱水浸提結(jié)合微波輔助法提取長根菇子實體中的多糖，在單因素實驗基礎(chǔ)上設(shè)計正交實驗，得出提取長根菇多糖的工藝條件。劉嬌英［18］則通過深層發(fā)酵加乙醇沉淀法獲得其胞外多糖。

本研究以長根菇子實體為原料，采用熱水浸提法提取多糖，以多糖提取率為指標，進行單因素實驗，在此基礎(chǔ)上運用響應(yīng)曲面分析法，確定了提取長根菇子實體多糖的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長根菇，福建省武夷山市悅和春天然食品農(nóng)民專業(yè)合作社提供;葡萄糖、無水乙醇、丙酮、無水乙醚、苯酚、濃H2SO4，均為分析純。

RHP-400型打粉機，浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司;CP124C先行者精密電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司制造;DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司;TDZ5-WS離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司;WH-1微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器有限公司;RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D型真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;V5000型分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 長根菇子實體多糖的提取

長根菇子實體干品粉碎過20目篩，稱取樣品5.0 g，添加蒸餾水，水浴浸提，5 000 r/min下離心15 min，重復(fù)提取若干次，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5～20 mL，加入3倍體積的95%vol乙醇靜置24 h，5 000 r/min離心15 min得沉淀，抽濾并用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌2～3次，真空冷凍干燥得子實體粗多糖。

1.2.2 多糖含量的測定方法

采用苯酚硫酸法［19］測定多糖含量。

多糖提取率的測定:取一定量子實體粗多糖復(fù)溶到一定體積的蒸餾水中，采用苯酚硫酸法測定其多糖含量。根據(jù)標準曲線A=0.803 6x-0.003 8(R2=0.999 3)，得出多糖含量。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計

選擇提取次數(shù)、提取溫度、時間及水料比4個單因素分別進行實驗:(1)提取次數(shù)設(shè)置1、2、3和4次4個梯度，提取溫度、時間及水料比分別是80℃、3 h和30∶1(mL∶g)(下同);(2)提取溫度設(shè)置 50、60、70、80和90℃5個梯度，提取時間、水料比及提取次數(shù)分別是3 h、30∶1和3次;(3)提取時間設(shè)置1、1.5、2、2.5和3 h5個梯度，提取溫度、水料比及提取次數(shù)分別是80℃、30∶1和3次;(4)提取水料比設(shè)置10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和 30∶1五個梯度，提取溫度、時間及提取次數(shù)分別是80℃、3 h和3次。

1.2.4 Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計

本實驗根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法，考察提取溫度、提取時間和水料比對多糖提取率的影響，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因子，以多糖提取率為響應(yīng)值作響應(yīng)面與等值線圖，分析優(yōu)化最佳提取條件。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗均為3次重復(fù)，采用SAS 8.0和Design Expert 8.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，Orgin8.0作圖，單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取次數(shù)對多糖提取率的影響

提取次數(shù)對多糖提取率的影響結(jié)果如圖1所示。提取1次時，處理不夠，多糖溶解不充分，提取率明顯不高。1次與2、3、4次之間多糖提取率差異顯著(P＜0.05)，2次與3次、3次與4次之間多糖提取率差異不顯著(P＞0.05)，但2次與4次之間多糖提取率差異顯著(P＜0.05)，如果選取4次會降低生產(chǎn)效率，增加操作工序，綜合經(jīng)濟成本和多糖產(chǎn)量考慮，選取提取3次作為RSM實驗的中心點。

圖1 提取次數(shù)對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction times on extraction rate of polysaccharide

2.1.2 提取溫度對多糖提取率的影響

提取溫度對多糖提取率的影響如圖2所示。隨著溫度的升高，多糖提取率也在增加。50、60和70℃之間多糖提取率差異性不顯著(P＞0.05)，80℃和90℃之間多糖提取率差異性也不顯著(P＞0.05)，但是50、60、70 與80、90 ℃間多糖提取率差異性顯著(P＜0.05)，隨著溫度的升高，多糖分子在水中的擴散系數(shù)和溶解度也升高，多糖能夠更大程度的擴散到提取溶劑中去。從節(jié)能及操作安全方面來考慮，選用80℃作為RSM實驗的中心點。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide

2.1.3 提取時間對多糖提取率的影響

提取時間對多糖提取率的影響如圖3所示。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide

隨著提取時間的增加，長根菇多糖提取率也逐步提高。一般來說，時間越長多糖溶出越多，但加熱和操作時間過長易導(dǎo)致多糖在結(jié)構(gòu)上有變化或破壞，2.5 h后多糖提取率趨于平緩。1、1.5與2 h之間多糖提取率具有顯著性差異 (P＜0.05)，2.5、3與2 h之間多糖提取率差異也顯著(P＜0.05)，而2.5 h與3 h之間多糖提取率差異不顯著(P＞0.05)。從節(jié)約時間和降低能耗的角度考慮，選擇2.5 h作為RSM實驗的中心點。

1.2.4 水料比對多糖提取率的影響

水料比對多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。隨著水料比的逐步提高，多糖充分溶脹，使其能夠更好的溶出，故當(dāng)水料比從 10∶1、15∶1到 20∶1，多糖提取率逐漸增多，在水料比為20∶1時達到最高值4.14%，隨后可能由于加水量的增多，料液濃縮時間過長導(dǎo)致部分多糖結(jié)構(gòu)被破壞，多糖提取率有所下降。料水比為10∶1、15∶1時的多糖提取率與20∶1時差異顯著(P ＜0.05)、25∶1、30∶1與 20∶1之間多糖提取率差異也顯著(P＜0.05)。為了盡量提高多糖提取率，減少用水量，從而降低后續(xù)蒸發(fā)濃縮工序的負荷，綜合考慮，選取水料比20∶1作為RSM實驗的中心點。

圖4 水料比對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of water-material ratio on extraction rate of polysaccharide

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝

2.2.1 多糖提取因素選取

在提取次數(shù)為3次的實驗條件基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken原理采用3水平3因素的分析法對提取時間、提取溫度、水料比3個因素進行實驗設(shè)計，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of RSM test

2.2.2 響應(yīng)面分析方案及數(shù)據(jù)分析

因素水平選取根據(jù)2.2.1單因素實驗的結(jié)果，采用Design-Expert軟件進行實驗方案設(shè)計，按照方案設(shè)計試驗得到數(shù)據(jù)，所得到的數(shù)據(jù)同樣采用此軟件處理，具體方案及結(jié)果見表2、表3。

17個試驗點分兩類:1～12是析因點，自變量取值在因素所構(gòu)成的三維頂點;13～17是零點，為區(qū)域的中心點，重復(fù)5次用以估計試驗誤差。從表2可以看出，在這些條件下多糖提取率為3.32% ～5.29%，且最高值出現(xiàn)在中心點條件下。提取率的預(yù)測值可由下面的多元二次方程進行預(yù)測計算:多糖提取率=5.24+0.379A+0.051B-0.005C-0.555AB-0.143AC-0.208BC-0.720A2-0.245B2-0.393C2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理Table 2 Program and results of RSM test

用F檢驗來判定各因子對長根菇多糖提取率影響的顯著性。由表3可知，因素A、各二次項與各交互項對多糖提取率的影響顯著，因素B、C對多糖的影響不顯著，且對多糖提取率的影響排序為A、AB、A2、C2＞ AC、BC、B2＞ B、C。說明各具體因素對響應(yīng)值的影響不是單一的線性關(guān)系。

表3 提取回歸分析結(jié)果Table 3 Results of extraction regression analysis

如回歸分析表3，回歸模型P值＜0.000 1，說明回歸模型極顯著。模型相關(guān)系數(shù)R=0.997 1(R2=0.994 2)說明通過二次回歸得到的多糖提取率實際值與預(yù)測值之間的擬合度很好，此方程可靠，可用此模型來預(yù)測多糖提取率的實際情況。為0.986 8說明長根菇多糖提取率總變異中僅有1.3%不能由回歸模型來解釋。失擬項P值為0.058 5＞0.05，說明失擬項相對于純誤差不顯著。表明在被檢測變量值的任意組合條件下，用模型方程預(yù)測長根菇多糖的提取提取率都是適合的。

2.2.3 因素間的交互影響

利用Design-Expert軟件，以多糖提取率為響應(yīng)值作響應(yīng)面分析圖(圖5～圖7)，直觀的給出了各個因子交互作用響應(yīng)面的3D圖。橢圓形等高線表明兩自變量間交互作用顯著，既長根菇多糖提取中提取溫度、時間、水料比變量間交互作用是顯著的。

圖5 浸提溫度(A)和提取時間(B)對長根菇子實體多糖提取率的影響Fig.5 Response surface for effect of extraction temperature and extraction time to extraction rate of polysaccharide

圖6 浸提溫度(A)和水料比(C)對長根菇子實體多糖提取率的影響Fig.6 Response surface for effect of extraction temperature and water-material ratio to extraction rate of polysaccharide

圖7 浸提時間(B)和水料比(C)對長根菇子實體多糖提取率的影響Fig.7 Response surface for effect of extraction time and water-material ratio to extraction rate of polysaccharide

響應(yīng)曲面法和等高線圖是回歸方程的圖表解釋法。從響應(yīng)面的最高點和等值線可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，既響應(yīng)面的最高點同時它也在等值線最小橢圓的范圍內(nèi)。運用Design-Expert軟件，可求出最優(yōu)提取條件為提取溫度83.96℃、提取時間2.32 h、水料比20.07∶1，在此條件下多糖的提取率達5.306%?？紤]到操作的方便性，將最優(yōu)提取參數(shù)確定為84℃、2.3 h、20∶1，此時的多糖提取率為5.169%。

2.2.4 提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗證

為了驗證模型方程的適用性，使用修正的最優(yōu)工藝參數(shù)進行了3次驗證性實驗。結(jié)果測定多糖提取率為5.85%，與回歸方程所得的預(yù)測值5.31%的誤差為9.23%，在誤差允許范圍內(nèi)(20%)內(nèi)。驗證試驗結(jié)果與模型預(yù)測的結(jié)果比較接近、實驗誤差較小、試驗擬合較好，說明應(yīng)用響應(yīng)面法提高長根菇子實體多糖提取率的回歸模型較可靠。

3 結(jié)論

回歸分析表明回歸模型極顯著，相關(guān)系數(shù)R值(0.997 1)接近1，表明提取率實際值與預(yù)測值有很好的擬合度。其中提取溫度、各二次項與各交互項對多糖提取率的影響顯著，提取時間、水料比對多糖提取率的影響不顯著，對多糖提取率的影響排序為A、AB、A2、C2＞ AC、BC、B2＞B、C(A 提取溫度、B 提取時間、C水料比)。說明各因素對響應(yīng)值的影響不是單一的線性關(guān)系。對實驗參數(shù)組合進行優(yōu)化，分析響應(yīng)曲面圖及等高線圖，得出最優(yōu)提取條件為84℃、2.3 h、20∶1，在此條件下，多糖的提取率預(yù)計值和實驗值分別為5.169%和5.85%，擬合較好，優(yōu)化出的長根菇子實體多糖提取條件切實可靠，為其進一步純化及工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。

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