崔建東，劉容麟

(河北科技大學，生物科學與工程學院，河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊，050018)

脂肪酶(EC3.1.1.3，Lipase)是一種重要的生物催化劑，是一類特殊的酯鏈水解酶。該酶能催化多種反應，如酯化、水解和聚合反應等，在食品工業(yè)中可用于油脂加工、乳品中乳脂的降解以及作為酯溶性抗氧化劑及營養(yǎng)強化劑等［1-2］。但游離的脂肪酶在應用過程中，表現(xiàn)出不穩(wěn)定、易失活的問題，限制了該酶的應用。大量研究表明，酶固定化技術(shù)能改善酶的穩(wěn)定性和催化性能［3-5］。

交聯(lián)酶聚體技術(shù)(CLEAs)是近年來國內(nèi)外固定化酶研究的熱點，該技術(shù)具有制備條件溫和、操作簡單、酶固定化效率和酶活保留率高等優(yōu)點。目前已經(jīng)被成功應用在苯丙氨酸解氨酶［6］、漆酶［7］、氨基?；福?］等多種酶的固定化。但該方法也存在一些缺點，如形成的固定化酶顆粒小、機械強度低等。特別是，如果被固定化的酶表面所含有的氨基(—NH2)較少，則難以用交聯(lián)劑(戊二醛)交聯(lián)，導致交聯(lián)固定化效率下降［9］。為了克服這個問題，有學者利用富含氨基的高分子多聚物和酶共沉淀交聯(lián)，以提高CLEAs的交聯(lián)效率［10-11］。但這些高分子聚合物含有大量的電荷，這些電荷會影響酶活性中心的微環(huán)境，導致酶的活性構(gòu)象改變［12］。牛血清白蛋白(BSA)是一種富含氨基的惰性蛋白，由于BSA自身是一種蛋白質(zhì)，對所要交聯(lián)固定的酶沒有負作用，因此是替代高分子聚合物提高CLEAs交聯(lián)效率的理想輔助交聯(lián)劑。因此，本研究以牛血清白蛋白作為一種輔助交聯(lián)劑，研究了BSA對牛胰脂肪酶CLEAs制備及其催化性能的影響，以期能顯著提高CLEAs固定化效率及催化效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛胰脂肪酶(lipase，15 mU/mg)，阿拉丁試劑(上海)有限公司;牛血清白蛋白，Sigma公司;50%戊二醛，阿拉丁試劑(上海)有限公司;其他試劑均為市售分析純。

S-4800-Ⅰ型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本HITACHI;IX51倒置熒光顯微鏡，美國OLYMPUS;752型紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司;TGL-16C型離心機，上海安亭科學儀器廠;HC-3018型高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司;85-1B磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司;FD-27真空冷凍干燥機，北京德天佑科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛血清白蛋白輔助交聯(lián)制備脂肪酶交聯(lián)酶聚體

取1.0 mL質(zhì)量濃度為100 mg/mL游離脂肪酶與50 mg/mL的牛血清白蛋白混合(pH 7.5，50以mmol/L磷酸緩沖液配制)置于7 mL離心管中，并加入硫酸銨使體系中硫酸銨濃度為80%使蛋白析出。之后加入體積分數(shù)為50%的戊二醛，使其終濃度為1%，在25℃下攪拌交聯(lián)1 h。離心分離后的沉淀用磷酸緩沖液(pH7.5，50 mmol/L)洗滌，獲得交聯(lián)脂肪酶聚集體(BSA-Lipase-CLEAs)。對于Lipase-CLEAs，除了在制備過程中不添加 BSA，其他制備條件與BSA-Lipase-CLEAs一致。

1.2.2 固定化脂肪酶的形態(tài)觀察

固定化脂肪酶樣品經(jīng)真空冷凍干燥后，在真空條件下噴鉑金，利用電子掃描顯微鏡(電子發(fā)射電壓60～100 kV)檢測。利用50 mg異硫氰酸熒光素(FITC)溶于8 mL二甲基亞砜(DMSO)，加入100 mL溶有1 g脂肪酶的磷酸鈉緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.5)，室溫下避光攪拌溶解2 h。加入無水乙醇(與溶液的量大約等量即可)沉淀標記好的蛋白，離心除去多余的FITC。沉淀需要清洗3次。標記好FITC的脂肪酶用于固定化，用熒光倒置顯微鏡觀察固定化酶。

1.2.3 酶活測定方法

用對硝基苯酚法測定脂肪酶酶活［13］。酶促反應液包括一定量的酶樣品(溶于50 mmol/L的磷酸緩沖液，pH 7.5)，5 mL 0.009 g/mL的對硝基乙酸酯，反應在37℃振蕩保溫5 min。10 000×g離心5 min，取上清液在410 nm下測吸光值。固定化酶的酶活測定與游離酶相似，根據(jù)對硝基苯酚標準曲線計算酶活。酶活力單位定義為:每分鐘催化對硝基乙酸酯生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活力單位。

1.2.4 酶活回收率(公式(1))

1.2.5 統(tǒng)計分析

所有實驗重復進行3次，利用SAS軟件(v8.0)進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 實驗設(shè)計

1.2.6.1 固定化酶制備條件優(yōu)化

利用單因素實驗考察了BSA添加質(zhì)量濃度(0，0.005，0.01，0.02，0.05 g/L)、戊二醛體積分數(shù)(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)以及交聯(lián)時間(0.5，1，1.5，2，2.5 h)對固定化酶的影響(考察某一因素時，其他制備條件不變，制備條件見1.2.1部分)。

1.2.6.2 固定化酶的動力學參數(shù)及最適催化條件考察

考察固定化酶的最適催化溫度，將一定量酶樣品分別在30、40、50、60和70℃條件下測定酶活，酶活的測定參照1.2.3部分。對于動力學參數(shù)的測定，取一定量的酶樣品測定不同底物濃度(120，110，100，90和80 μmol/L對硝基乙酸酯)下的酶促反應速率，利用雙倒數(shù)法得到Km和Vmax。

1.2.6.3 固定化酶的催化穩(wěn)定性考察

對于溫度穩(wěn)定性，將游離酶和固定化酶分別置于60℃下處理1、2和3 h后，分別檢測酶活。對于pH穩(wěn)定性，將游離酶和固定化酶分別置于pH為4、6、8、10和12的磷酸緩沖液中處理12 h后，檢測酶活。對于儲存穩(wěn)定性，將游離酶和固定化酶分別保存在50 mmol/L 磷酸鹽(pH 7.5)中，于25 ℃放置1、3、6、9 和12 d，并在相對應的儲存時間檢測酶活。重復使用穩(wěn)定性實驗:將一定量的固定化酶在37℃條件下催化底物對硝基乙酸酯生成對硝基苯酚，反應5 min后，離心分離出固定化酶，用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)洗滌后，在固定化酶中加入新的底物進行第2輪反應，依此分批催化，每次催化反應后分別檢測固定化酶剩余的酶活。直到檢測不到酶活為止。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化脂肪酶制備條件優(yōu)化

2.1.1 對硝基苯酚標準曲線制備

標準曲線方程:Y=5.907 9X+0.028 1，R2=0.999 9，以此計算酶活。

2.1.2 BSA濃度對固定化酶的影響

從圖1可以得出，BSA的添加對脂肪酶交聯(lián)酶聚體的酶活回收率有較大的影響，隨著BSA質(zhì)量濃度的增加，CLEAs的酶活回收率也在增加，當BSA質(zhì)量濃度為0.05 g/L時，最大酶活回收率達到70%(比不添加BSA制備的CLEAs酶活回收率提高了15%)。但當BSA濃度過大時，CLEAs的酶活回收率卻又有所下降。這表明富含氨基的BSA提高了脂肪酶的交聯(lián)效率，適當BSA的添加使大多數(shù)原本難以被戊二醛交聯(lián)的脂肪酶分子被充分的交聯(lián)，減少了脂肪酶分子的泄露，導致酶活回收率提高。但過量的BSA會與脂肪酶共同競爭戊二醛分子，使得戊二醛主要被用于交聯(lián)BSA，而脂肪酶分子難以充分被交聯(lián)，從而使脂肪酶的交聯(lián)效率下降［14］。

2.1.3 戊二醛濃度對固定化酶的影響

由圖2可以看出，隨著戊二醛體積分數(shù)的增加，固定化酶的酶活回收率也在增加，當戊二醛體積分數(shù)達到1%時，酶活回收率達到最高，而隨著戊二醛體積分數(shù)的繼續(xù)增加，酶活回收率卻開始下降。有研究表明，戊二醛不僅是酶蛋白的交聯(lián)劑，同時也會破壞酶蛋白的結(jié)構(gòu)，過量的戊二醛能進入酶的活性中心，破壞酶活性結(jié)構(gòu)，導致酶變性失活［15］。從而使酶活回收率下降。

圖1 BSA質(zhì)量濃度對酶活回收率的影響Fig.1 Effects of BSA concentration on activity recovery

圖2 戊二醛體積分數(shù)對酶活回收率的影響Fig.2 Effects of glutaraldehyde concentration on activity recovery

2.1.4 交聯(lián)時間對固定化酶的影響

從圖3可知，固定化酶的酶活回收率隨著交聯(lián)時間的增加而增加，交聯(lián)2 h，酶活回收率達到最大。但隨著交聯(lián)時間的繼續(xù)增加，酶活回收率下降。這可能是由于戊二醛既能作為酶蛋白的交聯(lián)劑，同時有是酶蛋白的失活劑，酶蛋白與戊二醛長時間的接觸會導致戊二醛直接作用酶分子的活性中性，改變酶的活性結(jié)構(gòu)，反而使酶失活。導致固定化酶酶活回收率有所下降。

圖3 交聯(lián)時間對固定化酶酶活的影響Fig.3 Effects of cross-linking time on activity

2.2 固定化酶的形態(tài)觀察

圖4是掃描電鏡和熒光倒置顯微鏡觀察的固定化酶的圖片。從圖4可以看出，在10 μm標尺下，沒有添加BSA制備的CLEAs的顆粒非常小，形態(tài)不規(guī)則，分布不均勻 (圖4a)，而添加BSA制備的CLEAs顆粒較大，且呈現(xiàn)出圓球狀的顆粒，分布較為均勻(圖4b)。這種均勻的球型結(jié)構(gòu)更有利于酶促反應過程中固定化酶均勻地分散在反應液中，減少空間位阻現(xiàn)象的發(fā)生。熒光倒置顯微鏡表明，標記有FITC的酶蛋白在蛋白聚體中發(fā)出綠光(圖4c，4d)，表明酶蛋白已經(jīng)被交聯(lián)固定化。但添加BSA的脂肪酶CLEAs發(fā)出更多、更強的熒光(圖4d)，表明BSA的添加能提高脂肪酶的交聯(lián)效率。

圖4 固定化酶的形態(tài)Fig.4 Morphology of immobilized lipase

2.3 固定化酶最適催化溫度和動力學參數(shù)

2.3.1 最適催化溫度

圖5是游離脂肪酶、未添加BSA制備的CLEAs和添加BSA制備的CLEAs的最適反應溫度。由圖5可以看出，經(jīng)過交聯(lián)固定化后，脂肪酶的最適反應溫度由50℃遷移到了60℃，最適溫度增加了10℃，當溫度從60℃升高到70℃時，固定化脂肪酶比游離酶表現(xiàn)出更高的催化活性。表明CLEAs比游離酶有更好的溫度適用性。

2.3.2 動力學參數(shù)

由表1可以看出，所有固定化的脂肪酶的Km均大于游離的脂肪酶，說明固定化導致底物與酶分子之間產(chǎn)生了底物擴散效應，從而使底物與酶活性中心的親和力降低，最大反應速率有所降低。但相比而言，添加 BSA制備的 CLEAs比未添加 BSA制備的CLEAs表現(xiàn)出相對高的底物親和力，催化效率(νmax/Km)也略高于未添加BSA制備的CLEAs。

圖5 固定化酶的最適催化溫度Fig.5 Effects of temperature on the activity of immobilized lipase

表1 固定化酶動力學參數(shù)Table1 Kinetic parameters of free lipase，lipase-CLEAs，and lipase-BSA-CLEAs

2.4 固定化酶催化穩(wěn)定性

2.4.1 固定化酶溫度穩(wěn)定性

圖6是固定化脂肪酶的溫度穩(wěn)定性曲線，結(jié)果表明，與游離酶相比，固定化酶具有更高的耐受高溫的能力，在60℃下處理3 h時，游離酶基本損失了50%的初始酶活，而CLEAs始終能保持70%以上的酶活，相對于CLEAs，BSA的添加能提高CLEAs耐受高溫的能力，處理 3 h后，添加 BSA的 CLEAs(Lipase-BSACLEAs)殘留的酶活要高于不添加BSA的CLEAs。說明BSA的添加不但增強了脂肪酶的交聯(lián)效率，而且大分子的BSA還能起到減緩高溫傳遞速度，保護脂肪酶使其不失活，從而降低了脂肪酶的失活速率。

圖6 固定化酶的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Thermostability of immobilized lipase

2.4.2 固定化酶pH穩(wěn)定性

圖7是固定化酶pH的穩(wěn)定性結(jié)果，與游離酶相比，所有的CLEAs在pH4～12時表現(xiàn)出較高的耐受性，而且，添加BSA制備的CLEAs比不添加BSA制備的CLEAs表現(xiàn)出更高的pH耐受性。例如，當在pH4的緩沖液中處理12 h時，Lipase-BSA-CLEAs酶活殘留率始終能保持在近80%，但Lipsae-CLEAs只有45%的酶活保留率，而游離酶在此條件下只有20%左右的酶活保留率，這些結(jié)果表明，通過將脂肪酶固定化成CLEAs，能顯著提高脂肪酶耐受酸堿的能力，而BSA的加入更有利于提高脂肪酶的交聯(lián)效率，降低了酶分子從酶聚體中的泄漏，從而提高了脂肪酶的穩(wěn)定性。

圖7 固定化酶的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH-stability of immobilized lipase

2.4.3 固定化酶儲存穩(wěn)定性

固定化酶的儲存穩(wěn)定性是評價固定化酶應用價值的重要指標［16］。圖8是固定化酶儲存25℃下的穩(wěn)定性結(jié)果，在儲存過程中，游離酶的酶活迅速下降，在儲存第6天時酶活只有初始酶活的50%。但所有固定化的CLEAs酶活都表現(xiàn)出明顯的增加，在儲存第6天時Lipase-CLEAs和Lipase-BSA-CLEAs的酶活分別達到最大，分別是初始酶活的229%和158%。這種現(xiàn)象也被Ferreira等［17］人發(fā)現(xiàn)。他們認為，這種明顯的提高可能是由于殘留在酶聚體內(nèi)部的戊二醛將沒有被完全交聯(lián)脂肪酶繼續(xù)交聯(lián)固定，同時，殘留的戊二醛也會誘導脂肪酶活性中心的變化，導致酶活增加。

圖8 固定化酶的儲存穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of immobilized lipase

2.4.4 固定化酶重復使用性

圖9是固定化酶的重復使用穩(wěn)定性結(jié)果。添加BSA制備的CLEAs的重復使用穩(wěn)定性要優(yōu)于不添加BSA制備的CLEAs，經(jīng)過連續(xù)的7次重復使用后，Lipase-BSA-CLEAs還能保留初始酶活的80%左右，但Lipase-CLEAs只有初始酶活的30%，這個結(jié)果說明，BSA的添加增強了脂肪酶的交聯(lián)效率，脂肪酶的泄漏減少，從而使固定化酶的重復使用性更好。

圖9 固定化酶重復使用穩(wěn)定性Fig.9 Recycling stability of immobilized lipase

3 結(jié)論

通過研究BSA的添加對脂肪酶交聯(lián)酶聚體制備及穩(wěn)定性的影響，獲得最適的固定化酶制備條件是:BSA的最適添加質(zhì)量濃度是0.05 g/L，戊二醛的體積分數(shù)為1%，交聯(lián)時間是2 h。所得固定化酶的最大酶活回收率是70%。與不添加BSA所制備的CLEAs相比，酶活回收率增加了15%。同時，添加BSA所制備的CLEAs表現(xiàn)出較好的溫度適用性、pH和儲存穩(wěn)定性，而且還具有優(yōu)秀的重復使用穩(wěn)定性，在連續(xù)重復使用7批次后，添加BSA所制備的CLEAs還能保持初始酶活的近80%。上述結(jié)果表明，這種通過添加BSA制備交聯(lián)酶聚體是提高交聯(lián)酶聚體催化效率的有效方法。

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