王穎，范銘，薛素妹，錢凱，齊斌，朱益波

1(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春，130118)

2(常熟理工學(xué)院生物與食品學(xué)院，蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，江蘇常熟，215500)

苯基乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羥基-3-苯基丙酸，是一種應(yīng)用廣泛的手性化合物［1-3］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)PLA對(duì)大多數(shù)食源性致病細(xì)菌和真菌具有廣譜而高效的抗菌活性［4-7］，引起食品行業(yè)普遍關(guān)注。PLA作為乳酸菌苯丙氨酸的代謝產(chǎn)物，對(duì)人體和動(dòng)物細(xì)胞均無毒性［8-10］，是一種天然生物防腐劑。此外，它還具有溶解性好和熱穩(wěn)定性高、有效pH范圍寬、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，有利于其未來在食品工業(yè)的普遍應(yīng)用［11-14］。

L-苯基乳酸(L-phenyllactic acid，L-PLA)作為PLA兩種手性對(duì)映異構(gòu)體［15］中的一種，具有特殊的生物活性，可以作為手性中間體廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、農(nóng)藥和生物合成等領(lǐng)域［16］。采用聚苯基乳酸替代礦物類工程塑料有助于減少礦物能源消耗和溫室氣體排放［17］。目前微生物轉(zhuǎn)化合成D-PLA和L/DPLA消旋體［18-20］的研究較多，攜帶 Lactobacillus plantarum subsp.plantarum基因D-ldhY52V突變體的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhD由于關(guān)鍵位點(diǎn)基因突變導(dǎo)致重組菌轉(zhuǎn)化能力明顯提高至77%摩爾轉(zhuǎn)化率［21］。ZHENG［22］報(bào)道用凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans SDM)全細(xì)胞生產(chǎn)苯基乳酸產(chǎn)量高達(dá)37.3 g/L，轉(zhuǎn)化率為70%。Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293［23］生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-PLA最大值35 mmol/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)75.2% ～83.3%。但目前報(bào)道D-PLA合成的文獻(xiàn)較多，關(guān)于L-PLA合成的報(bào)道較少，且產(chǎn)量和光學(xué)純度仍不理想。采用高效便捷的方法合成高光學(xué)純度是L-PLA大量投入應(yīng)用的前提。而生物催化因其高效和高度的立體選擇性，成為手性合成最重要的方法之一。

乳酸脫氫酶是微生物合成PLA的一種關(guān)鍵酶，但由于微生物細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，限制苯基乳酸合成［24］。因此，利用基因工程手段獲得高效過表達(dá)乳酸脫氫酶的重組菌是提高苯基乳酸產(chǎn)量的有效途徑。本研究構(gòu)建了1株能夠高效表達(dá)L-乳酸脫氫酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL，此重組菌具有較高的還原苯丙酮酸(phenylpyruvic acid，PPA)生產(chǎn)L-PLA能力，可為進(jìn)一步提高微生物合成PLA的產(chǎn)率、光學(xué)純度和底物轉(zhuǎn)化率提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

L-苯基乳酸、D-苯基乳酸和苯丙酮酸鈉，國藥集團(tuán);酵母提取物和胰蛋白胨，英國Oxoid公司;IPTG、DNA 聚合酶、DNA Marker、NADH(BBI)、X-Gal、硫酸卡那霉素、相關(guān)分子試劑盒、引物合成和DNA測(cè)序，上海生物工程公司;T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶，大連寶生物公司(TaKaRa);B-PER細(xì)菌總蛋白提取試劑，德國Thermo公司;所有實(shí)驗(yàn)試劑如果無特殊說明均為分析純。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

pMD19-T Simple Vector大連寶生物公司(TaKa-Ra);E.coli JM109，E.coli BL21(DE3)，pET-28a(+)均為實(shí)驗(yàn)室保藏。

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。根據(jù)需要，在培養(yǎng)基中添加50 μg/mL的硫酸卡那霉素。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀、水平電泳系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、微孔板分光光度計(jì)，美國 Bio-RAD公司;高速臺(tái)式離心機(jī)，德國Thermo公司;恒溫金屬浴，德國 Eppendorf公司;高效液相色譜儀，日本島津公司;恒溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分子克隆

基因組DNA的提取純化、質(zhì)粒DNA的提取純化、DNA酶切、連接和轉(zhuǎn)化、感受態(tài)細(xì)胞制備均參照文獻(xiàn)［25］。根據(jù)美國國家生物技術(shù)中心(National Center ofBiotechndogy Information，NCBI)中 已 知 的B.megaterium WSH-002 L-乳酸脫氫酶基因(1dhL)序列設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物:5’-GCGCCCATATGATGAAAACACAATTTAC-3’;下游引物:5’-CCGGGATCCTTACACAAAAGCTCTG-3’。為了便于克隆與連接，上游引物5’設(shè)計(jì)了Nde I酶切位點(diǎn)，下游引物5’設(shè)計(jì)了BamH I酶切位點(diǎn)。

以巨大芽孢桿菌 B.megaterium Z2013513(CCTCC:M2013244)基因組為模板，對(duì)ldhL基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL):10×PCR Buffer 5 μL，上下游引物(10 pmol)各2 μL，Mg2+(25 mmol/L)3 μL，dNTP 1 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)1 μL，基因組模板 2 μL，滅菌超純水 36 μL。PCR 擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將膠回收的目的基因片段亞克隆到pMD19-T簡(jiǎn)易載體，用T4DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109中，根據(jù)藍(lán)白斑篩選陽性克隆。通過雙酶切鑒定后，獲得陽性克隆子E.coli JM109/pMD19-T-ldhL，送往上海生工進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ldhL的構(gòu)建

將克隆載體pMD19-T-ldhL經(jīng)Nde I和BamH I雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳膠回收，獲得目的基因ldhL，連接至經(jīng)Nde I和BamH I雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)質(zhì)粒酶切和菌落PCR驗(yàn)證，獲得重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-28a-ldhL。

1.3.3 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取 E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL、E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)和 E.coli BL21(DE3)單菌落分別接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)過夜。按1%的接種量(體積分?jǐn)?shù))轉(zhuǎn)接入100 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中，37℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.4～1.0，添加IPTG至終濃度為1 mmol/L，于25℃，200 r/min誘導(dǎo)表達(dá)6 h。取誘導(dǎo)后菌液，8 000 r/min、4℃離心5 min，菌泥經(jīng)超純水洗滌2遍后稀釋至OD600值為1，取1 mL稀釋液離心收集菌體，加入100 μL超純水和30 μL 5×上樣緩沖液，充分混勻后沸水浴加熱5 min，12 000 r/min、4 ℃ 離心 5 min，取10 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。以12%的凝膠作分離膠，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R250染色。經(jīng)脫色液脫色后凝膠成像分析重組蛋白表達(dá)情況。

1.3.4 乳酸脫氫酶酶活力測(cè)定

誘導(dǎo)活化后的菌株E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)/pET-28a和E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL經(jīng)離心洗滌后稀釋至OD600值為1，取1 mL稀釋液離心收集菌體，加入500 μL B-PER試劑，充分混勻后30℃渦旋裂解10 min，12 000 r/min、4℃離心5 min，取適量上清液進(jìn)行乳酸脫氫酶酶活測(cè)定。

乳酸脫氫酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)［26］并做適當(dāng)修改，基本原理是鑒于NADH在340 nm處有最大吸收峰，通過光吸收峰值的改變定量測(cè)定酶的含量。酶活測(cè)定溫度 30℃，3 mL的反應(yīng)體系:pH 7.0，100 mmol/L磷酸鈉緩沖液，含10 mmol/L苯丙酮酸鈉，0.4 mmol/L NADH和適量粗酶液。在30℃、pH 7.0條件下，每分鐘消耗1 μmol/L NADH所需的酶量為1個(gè)酶活單位(U/mL)。比酶活定義為:1 mg酶蛋白所含的酶活單位(U/mg)。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法:Bradford法［27］，以不同濃度的牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA合成L-PLA

菌體活化:從固體培養(yǎng)基上挑取E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL單菌落接種至裝有10 mL新鮮LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)的100 mL三角瓶中培養(yǎng)，37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。

重組菌誘導(dǎo)及L-PLA合成:將活化好的重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL按1%(體積比)的接種量接種至裝有100 mL新鮮LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)的500 mL三角瓶中，200 r/min、37℃培養(yǎng)至 OD600值為 1.2，加入誘導(dǎo)劑 IPTG至 0.2 mmol/L，25℃誘導(dǎo)6 h后，4℃、6 000 r/min離心5 min收集菌體。菌體用pH為7.0的磷酸鈉緩沖液洗滌2次，重懸于10 mL磷酸鈉緩沖液中，反應(yīng)60 min后取500 μL轉(zhuǎn)化液經(jīng)10 000 r/min，4℃離心5 min，上清進(jìn)行HPLC檢測(cè)產(chǎn)物L(fēng)-PLA和底物PPA物質(zhì)的量濃度，菌泥進(jìn)行OD600值檢測(cè)。

1.3.6 高效液相色譜分析方法

將轉(zhuǎn)化液離心，取上清液與流動(dòng)相混合均勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后采用HPLC檢測(cè)L-PLA物質(zhì)的量和光學(xué)純度。PPA和L-PLA定量檢測(cè)條件:色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H;流動(dòng)相為5 mmol/L稀硫酸;流速0.6 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣體積5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。L-PLA光學(xué)純度檢測(cè)條件為:手性柱OJ-RH，流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(三氟乙酸)∶V(去離子水)=50∶50∶1.5∶900，流速 0.3 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量5 μL。

1.3.7 PPA摩爾轉(zhuǎn)化率計(jì)算［公式(1)］

2 結(jié)果與分析

2.1 ldhL基因克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以B.megaterium Z2013513基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段大小約1.0 kb，(如圖1A)，片段大小與預(yù)期相符。將PCR產(chǎn)物連接至克隆質(zhì)粒pMD19-T簡(jiǎn)易載體，經(jīng)測(cè)序分析，ldhL基因長(zhǎng)度為957 bp，表明已擴(kuò)增到ldhL基因。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ldh L圖譜如圖2所示。重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-ldh L和重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ldh L經(jīng)Nde I和BamH I雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果分別如圖1B和圖3A，表明克隆質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒均構(gòu)建成功。E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldh L菌落PCR電泳圖如3B，表明重組大腸桿菌能成功克隆并轉(zhuǎn)錄ldh L基因。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(A);重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-ldhL(B)的酶切鑒定Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification(A);Restrication analysis of recombinant cloning plasmid pMD19-T-ldhL(B)

圖2 pET-28a-ldhL質(zhì)粒圖譜Fig.2 Map of recombinant plasmid pET-28a-ldhL

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ldhL的酶切鑒定(A);菌落PCR鑒定(B)電泳圖Fig.3 Restrication analysis of recombinant cloning plasmid pET-28a-ldhL(A);Electrophoresis of clone PCR verification(B)

2.2 ldhL基因的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測(cè)定

對(duì)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL、E.coli BL21(DE3)/pET-28a 和原始菌株E.coli BL21(DE3)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照菌株相比，E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL在約40 ku處有明顯條帶，除去質(zhì)粒上融合表達(dá)的融合標(biāo)簽，與預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白大小一致，表明巨大芽孢桿菌ldhL在大腸桿菌中成功表達(dá)。

圖4 SDS-PAGE分析重組大腸桿菌L-乳酸脫氫酶蛋白表達(dá)Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant L-lactate dehydrogenase expression in E.coli

對(duì)E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL粗酶液酶活和蛋白表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，未檢測(cè)出對(duì)照菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a和 E.coli BL21(DE3)對(duì) PPA的酶活，重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL對(duì)PPA的比酶活為3.4 U/mg，說明重組ldhL在大腸桿菌中成功表達(dá)且對(duì)PPA顯示出催化活力。

2.3 重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA合成L-PLA

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明E.coli BL21(DE3)/pET-28aldhL對(duì)PPA具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力。在37℃、200 r/min條件下轉(zhuǎn)化60 min，70.32 mmol/L PPA經(jīng)25 g/L(干重)重組大腸桿菌將全細(xì)胞轉(zhuǎn)化還原為50.59 mmol/L LPLA，底物摩爾轉(zhuǎn)化率為71.94%。HPLC檢測(cè)結(jié)果見圖5:此轉(zhuǎn)化體系不對(duì)稱還原PPA合成的L-PLA具有較高的光學(xué)純度(96.98%e.e.)，以上結(jié)果表明此一步生物轉(zhuǎn)化體系能高效地不對(duì)稱合成L-PLA。

圖5 HPLC分析重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLAFig.5 HPLC analysis of L-PLA production by whole cells of recombinant E.coli

3 結(jié)論

Rubrivivax benzoatilyticus JA2［28］可將 1 mmol/L L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為 0.92 mmol/L L-PLA。1996年，Hashimoto［29］等從土壤中篩選1株假單胞菌(Pseudomonas sp.)，能將2-羥基3-苯基丙腈(3-phenyllactonitrile)轉(zhuǎn)化為e.e.值為75%的L-PLA。本研究通過構(gòu)建過表達(dá)L-乳酸脫氫酶的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL，采用全細(xì)胞一步生物轉(zhuǎn)化法，將PPA高效不對(duì)稱還原成高光學(xué)純度L-PLA，為進(jìn)一步提高微生物合成L-PLA的產(chǎn)率、光學(xué)純度和底物轉(zhuǎn)化率提供依據(jù)。

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