饒勝其，陳素雅，魏永峰，高璐，尹永祺，楊振泉，方維明

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州，225127)

黃曲霉(Aspergillus flavus)是一種常見(jiàn)的霉菌，是子囊菌亞門(mén)(Ascomycotina)、曲霉屬(Aspergillus)常見(jiàn)的腐生型好氧真菌。黃曲霉的次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素是一類(lèi)以二呋喃環(huán)(毒性作用)和氧雜萘鄰?fù)?致癌作用)為基本結(jié)構(gòu)的化合物，迄今已報(bào)道B1、B2、G1、G2、M1、M2和毒醇等 20 種，其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)的毒性和致癌性最強(qiáng)。黃曲霉毒素廣泛存在于農(nóng)產(chǎn)品和食品中［1-3］。目前，防治黃曲霉及其毒素污染的重要手段是使用抗生素及化學(xué)制劑，但隨之導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生及抗生素殘留等問(wèn)題。隨著人們對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)品質(zhì)量和安全性的日益重視，生物防治正在逐步取代抗生素和化學(xué)制劑。芽孢桿菌已是重要的農(nóng)業(yè)生防菌，其產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)主要包括脂肽類(lèi)抗生素Surfactin、Iturin和Fengycin等和蛋白類(lèi)幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等［4-5］，具有較強(qiáng)的廣譜抗真菌活性。許多研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)在生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生一系列抑制真菌和細(xì)菌活性的代謝物，已證實(shí)的抑菌物質(zhì)包括抑菌蛋白類(lèi)、脂肽類(lèi)抗生素、大環(huán)類(lèi)酯類(lèi)、肽類(lèi)、聚酮化合物等，在抑制病原菌、環(huán)境保護(hù)、動(dòng)物生產(chǎn)等方面已顯示出益生菌的用途［6-10］。

在我們前期研究中，從黑胡椒中分離出1株對(duì)黃曲霉有較強(qiáng)抑制作用的菌株F1(保藏號(hào)CGMCC No.10942)，依據(jù)菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征結(jié)合16S rDNA基因序列分析、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建鑒定菌株為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens，命名為B.amyloliquefaciens F1。而且，研究已證實(shí)菌株F1的抑菌成分為分子質(zhì)量為30 k～100 ku的蛋白類(lèi)物質(zhì)，具有良好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。在本研究中，擬從以下兩方面展開(kāi):(1)對(duì)B.amyloliquefaciens F1的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行初步優(yōu)化，以期提高其黃曲霉抑制能力;(2)考察B.amyloliquefaciens F1發(fā)酵液對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 菌株

B.amyloliquefaciens F1，產(chǎn)毒黃曲霉，由揚(yáng)州大學(xué)食品微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室從海南黑胡椒體表分離純化。

1.1.3 主要試劑

KNO3、蔗糖、D-果糖、可溶性淀粉、乙腈(色譜純)、正己烷、異戊醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Glycine，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.4 主要儀器、設(shè)備

ZHJH-C1209B型垂直流超凈工作臺(tái)，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;GHX-92708-1型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;TG-16WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SS-325高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY公司;液相色譜，日本島津公司;CAR/PDMS SPME萃取頭，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.1.5 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉 5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨 2 g，乙酸鈉 5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g ，MnSO4·4H2O 0.25 g，加入蒸餾水，定容至1 000 mL，調(diào)pH至6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株F1生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

將凍存于-20℃冰箱中的B.amyloliquefaciens F1細(xì)菌保種管在4℃解凍，吸取100 μL菌液轉(zhuǎn)接于含100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的300 mL錐形瓶中，30℃搖床(140 r/min)振蕩培養(yǎng)30 h，其中，每隔2 h取樣進(jìn)行平板涂布，倒置培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2 菌株F1抗菌培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化

1.2.2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)F1發(fā)酵液抑菌活性的影響

分別吸取100 μL菌液轉(zhuǎn)接于含100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的300 mL 錐形瓶中，25，28，30，32，35，37 ℃ 搖床(140 r/min)振蕩培養(yǎng)48 h后，測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性。

1.2.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)F1發(fā)酵液抑菌活性的影響

營(yíng)養(yǎng)肉湯配制好后，分別調(diào)pH值至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 后高壓滅菌，按 1.2.2.1 的方式接種，30℃搖床(140 r/min)振蕩培養(yǎng)48 h后，測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性。

1.2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株F1抑菌效果的影響

按1.2.2.1的方式接種，自然pH值，30℃搖床(140 r/min)振蕩培養(yǎng)，取培養(yǎng)不同時(shí)間(24，36，48，60，72 h)的發(fā)酵上清液，測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性。

1.2.3 菌株F1抗菌培養(yǎng)基成分優(yōu)化

(1)碳源。以營(yíng)養(yǎng)肉湯為基礎(chǔ)空白對(duì)照培養(yǎng)基(自然pH與1.2.2.2的優(yōu)化結(jié)果相同，故無(wú)需再調(diào)節(jié)pH)分別添加0.1%的葡萄糖、蔗糖、D-果糖、乳糖和可溶性淀粉，按1.2.2.1的方式接種，32℃搖床(140 r/min)振蕩培養(yǎng)48 h測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性。

(2)氮源。以營(yíng)養(yǎng)肉湯為基礎(chǔ)空白對(duì)照培養(yǎng)基，分別添加0.1%的酵母抽提物、胰蛋白胨、檸檬酸銨和硝酸銨，按1.2.2.1的方式接種，32℃搖床(140 r/min)振蕩48 h培養(yǎng)測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性。

(3)微量元素。以營(yíng)養(yǎng)肉湯為基礎(chǔ)空白對(duì)照培養(yǎng)基，分別添加一定量的微量元素MnSO4·4H2O(22.3 mg/L)、ZnSO4·7H2O(22.3 mg/L)、CuSO4·5H2O(0.025 mg/L)、FeSO4·7H2O(27.8 mg/L)、Mg-SO4·7H2O(440 mg/L)、KNO3(190 mg/L)、甘氨酸(2.0 mg/L)、L-谷氨酸(2.0 mg/L)，按 1.2.2.1 的方式接種，32℃搖床(140 r/min)振蕩培養(yǎng)48 h測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性。

(4)最佳成分單因素試驗(yàn)。已篩選出最佳碳源蔗糖、氮源檸檬酸銨、微量元素硝酸鉀，以營(yíng)養(yǎng)肉湯為基礎(chǔ)空白對(duì)照培養(yǎng)基，分別添加 0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%的蔗糖，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%的檸檬酸銨，95，190，285，380，475 mg/L的 KNO3，按濃度從高到低編組號(hào) 2、3、4、5、6，空白對(duì)照組為1號(hào)。按1.2.2.1的方式接種，32℃搖床(140 r/min)振蕩培養(yǎng)48 h測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性。

1.2.4 菌株F1發(fā)酵液對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的影響

取B.amyloliquefaciens F1接種入優(yōu)化后的培養(yǎng)基(0.4%蔗糖、0.2%檸檬酸銨、0.02%KNO3，初始pH值5.5)中，32℃，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，8 000 r/min離心20 min，取上清液過(guò)0.22 μm水系濾膜，依次使用膜截留分子質(zhì)量分別為100 ku和30 ku的超濾離心管進(jìn)行超濾處理(4 000 g，4℃，離心45 min)，收集30 k～100 ku的超濾液，即為菌株F1超濾抗菌液。

黃曲霉孢子懸液制作方法同1.2.5，調(diào)整濃度至106個(gè)/mL。每個(gè)錐形瓶加入PDA(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基)150 mL，高壓滅菌后放至室溫，每個(gè)錐形瓶加入300 μL黃曲霉孢子懸液，空白對(duì)照組未加入B.amyloliquefaciens F1超濾抗菌液，其余兩組分別加入10%和20%的超濾抗菌液，每組設(shè)3個(gè)平行，150 r/min，30℃搖瓶培養(yǎng)，3 d后測(cè)定菌絲干重，5 d后測(cè)定黃曲霉毒素。

1.2.5 霉菌孢子懸浮液制備

將保存在PDA斜面培養(yǎng)基上的霉菌接種到PDA平板，28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 d后，加入無(wú)菌PBS緩沖液，滅菌大槍頭尖頭輕刮培養(yǎng)基上的孢子，然后將含有霉菌孢子和菌絲的混懸液通過(guò)滅菌八層紗布的藍(lán)蓋瓶中以過(guò)濾掉霉菌菌絲，渦旋振蕩，10倍稀釋法分別稀釋10、100、1 000倍后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后將計(jì)數(shù)好的霉菌孢子原液用無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液統(tǒng)一調(diào)整至105個(gè)/mL，4℃冰箱貯藏備用。

1.2.6 抑菌率測(cè)定

將菌株F1接種入營(yíng)養(yǎng)肉湯中按照一定條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用0.22 μm聚醚砜樹(shù)脂(PES)水系濾膜過(guò)濾除菌。吸取1 mL無(wú)菌上清液傾注至無(wú)菌平板內(nèi)，倒入10 mL PDA培養(yǎng)基輕輕混勻，待培養(yǎng)基冷卻凝固，用直徑為6 mm打孔器在中央打孔，向孔中注入20 μL濃度為104個(gè)/mL的黃曲霉孢子懸液，空白培養(yǎng)基代替上清液作為對(duì)照，30℃培養(yǎng)3 d后測(cè)霉菌直徑，每組3個(gè)平行，以抑菌率(%)表示拮抗細(xì)菌上清液的抑菌效果，計(jì)算公式為:

1.2.7 菌絲干重測(cè)定

參照左瑞雨等［11］的方法，采用PDA培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)黃曲霉孢子3 d后，大量菌絲已長(zhǎng)出，中速定性濾紙過(guò)濾培養(yǎng)液，蒸餾水沖洗3遍以除去培養(yǎng)基黏性成分，過(guò)濾得到的菌絲連同濾紙放入大號(hào)平皿中(濾紙和平皿提前烘干至恒重并稱(chēng)重)，90℃干燥烘干至恒重，之后將菌絲放入干燥器中充分干燥至恒重，則黃曲霉菌絲質(zhì)量為干燥后的總體質(zhì)量與干燥前平皿與濾紙質(zhì)量之差。

1.2.8 黃曲霉毒素含量測(cè)定

毒素提取及濃度檢測(cè)參照許艷麗等［12］的方法，進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。具體步驟如下:將1.2.1.1中培養(yǎng)了5 d的培養(yǎng)液按1.2.1.2的方法過(guò)濾，收集濾液，準(zhǔn)確量取15 mL過(guò)濾液于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，重復(fù)3次后，5 000 r/min離心5 min，取上清液10 mL過(guò)多功能凈化柱，從多功能凈化柱的收集池內(nèi)轉(zhuǎn)移3 mL凈化液到棕色具塞小瓶中60℃ ±1℃氮?dú)獯蹈?，分別加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，密閉混勻60 s后，在40℃ ±1℃烘箱中衍生15 min。樣品衍生后于室溫下氮?dú)獯蹈?，采?00 μL 水-乙腈(85%/15%)溶解，3 000 r/min離心15 min，取上清液過(guò)膜到進(jìn)樣瓶中供測(cè)定用。

色譜條件:色譜柱，RP-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱溫，20℃;流動(dòng)相，乙腈(色譜純)+水;熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)，360 nm;發(fā)射波長(zhǎng)，440 nm;進(jìn)樣量，10 μL;流速，5 mL/min。梯度洗脫如下:0 ～10 min，15%～40%乙腈;10～28 min，40%乙腈;28～30 min，40%～15%乙腈。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s多重分析進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn)，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株F1生長(zhǎng)曲線(xiàn)

如圖1所示，新保種的F1在營(yíng)養(yǎng)肉湯中30℃搖瓶培養(yǎng)，2 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，之后快速生長(zhǎng)，14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)菌落總數(shù)達(dá)到5.2×107CFU/mL，到30 h時(shí)仍保持在高生物量。

圖1 B.amyloliquefaciens F1生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖Fig.1 The growth curve of B.amyloliquefaciens F1

2.2 菌株F1抗菌培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)F1發(fā)酵液抑菌活性的影響

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)所屬芽孢桿菌(Bacillus)，其最適生長(zhǎng)溫度為28～30℃［13］，但微生物最適生長(zhǎng)溫度不一定就是目標(biāo)產(chǎn)物代謝最佳溫度。值得說(shuō)明的是，前期研究已證實(shí)菌株F1的抑菌成分為分子量30 k～100 ku的蛋白類(lèi)物質(zhì)，具有良好的熱穩(wěn)定性，在溫度70℃以下處理30 min，其活性完全不受影響(相關(guān)系列數(shù)據(jù)已投稿其他雜志)。在本研究中，選取25～37℃考察不同溫度對(duì)B.amyloliquefaciens F1抑菌蛋白合成的影響，如圖2所示，隨著培養(yǎng)溫度的上升，F(xiàn)1發(fā)酵液抗菌活性先升后降，在32℃達(dá)到最高，后逐漸下降;其生物量呈先上升趨勢(shì)，32℃后變化較小。因此，F(xiàn)1產(chǎn)抗菌物質(zhì)最佳培養(yǎng)溫度為32℃。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)B.amyloliquefaciens F1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.2 The influences of cultural temperature to B.amyloliquefaciens F1 broth’s antifungal activity

2.2.2 初始pH值對(duì)F1發(fā)酵液抑菌活性的影響

解淀粉芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)pH值為6.5～7.0［13］，但微生物最適生長(zhǎng)pH不一定就是目標(biāo)產(chǎn)物代謝最佳pH。此外，前期研究已證實(shí)菌株F1所分泌抗真菌蛋白在pH值5.0～8.0，其相對(duì)抗菌活性均在80%以上，其中弱酸性環(huán)境對(duì)其抗真菌活性影響不大。培養(yǎng)基初始pH影響菌體自身生長(zhǎng)和代謝物的產(chǎn)生，菌株F1產(chǎn)抑菌物質(zhì)受培養(yǎng)基初始pH的影響如圖3所示，在pH為5.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌株F1上清液的抗菌活性最高;相比堿性環(huán)境，弱酸性環(huán)境更有利于菌F1的生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明，微酸性環(huán)境更有利于F1產(chǎn)抗菌物質(zhì)。

圖3 培養(yǎng)pH對(duì)B.amyloliquefaciens F1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.3 The influences of cultural pH to B.amyloliquefaciens F1 fermentation broth’s antifungal activity

2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F1發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖4可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，B.amyloliquefaciens F1菌體生物量及發(fā)酵液抑菌活性不斷增加，48 h后，菌體生物量及抑菌活性變化較小，可見(jiàn)抗菌物質(zhì)隨F1菌體的生長(zhǎng)代謝不斷積累，累積曲線(xiàn)類(lèi)似典型的細(xì)菌生長(zhǎng)S曲線(xiàn)，進(jìn)一步說(shuō)明了抗菌物質(zhì)為F1的體外代謝產(chǎn)物，且穩(wěn)定存在于菌液中。為經(jīng)濟(jì)節(jié)約，選取48 h為F1產(chǎn)抗菌物質(zhì)為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)B.amyloliquefaciens F1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4 The influences of cultural time to B.amyloliquefaciens F1 fermentation broth’s antifungal activity

綜上，菌株F1產(chǎn)抗真菌蛋白的適宜培養(yǎng)條件為:溫度32℃，初始pH值5.5，培養(yǎng)時(shí)間48 h。

2.3 B.amyloliquefaciens F1抗菌培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 碳源

B.amyloliquefaciensF1在添加了同一濃度不同種類(lèi)碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，發(fā)酵上清液對(duì)黃曲霉的抑制效果如圖5所示，與對(duì)照組相比，添加碳源對(duì)生物量的影響變化不大，OD600值均在2.1～2.3;添加碳源(包括長(zhǎng)效大分子淀粉和速效小分子的果糖和葡萄糖)能普遍提高B.amyloliquefaciens F1的抑菌效果，蔗糖能使同等條件下的抑菌率由46.5%提高到65.5%，淀粉其次，為55.5%。因此，本批試驗(yàn)所選擇的5種碳源中，選取蔗糖為最佳碳源。

圖5 碳源對(duì)B.amyloliquefaciens F1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.5 The influences of cultural carbon to B.amyloliquefaciens F1 fermentation broth’s antifungal activity

2.3.2 氮源

由圖6可知，與對(duì)照組相比，添加不同氮源對(duì)菌F1的生物量影響不大，OD600值均在2.1～2.3;在試驗(yàn)選取的4種氮源中，檸檬酸銨能有效提高B.amyloliquefaciens F1產(chǎn)抑菌物質(zhì)的能力(P＜0.05)，使得上清液對(duì)黃曲霉的抑制能力從46.5%提高到62.0%。

圖6 氮源對(duì)B.amyloliquefaciens F1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.6 The influences of cultural cnitrogen to B.amyloliquefaciens F1 fermentation broth’s antifungal activity

2.3.3 微量元素

由圖7可知，根據(jù)各不同元素適宜添加濃度添加到培養(yǎng)基后，與對(duì)照組相比，各添加組中B.amyloliquefaciens F1生物量變化不大，OD600值均在2.0～2.3;菌F1發(fā)酵液抑菌活性有不同程度升高，其中K+能顯著增加F1拮抗性能(P＜0.05)，故選取KNO3作為最佳微量元素進(jìn)一步做單因素優(yōu)化試驗(yàn)。

圖7 微量元素對(duì)B.amyloliquefaciens F1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.7 The influences of cultural trace elements to B.amyloliquefaciens F1 broth’s antifungal activity

2.3.4 培養(yǎng)基成分單因素

本研究根據(jù)已確定的最佳培養(yǎng)基成分，從中心濃度出發(fā)，設(shè)定相關(guān)不同濃度下F1發(fā)酵上清液對(duì)黃曲霉真菌抑制活性。由圖8可知，碳源蔗糖的最適添加濃度為3號(hào)試驗(yàn)組的0.4%，氮源檸檬酸銨的最適添加濃度為3號(hào)試驗(yàn)組的0.2%，硝酸鉀的最適添加濃度為3號(hào)試驗(yàn)組的1.90 mg/mL。綜上，B.amyloliquefaciens F1產(chǎn)抗菌物質(zhì)的適宜發(fā)酵培養(yǎng)基為:在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中添加0.4%蔗糖、0.2%檸檬酸銨和0.02%硝酸鉀。優(yōu)化后B.amyloliquefaciens F1發(fā)酵上清液對(duì)黃曲霉的抑菌率達(dá)到75.2%，比優(yōu)化前提高了60.1%。

圖8 蔗糖、檸檬酸銨、硝酸鉀濃度對(duì)B.amyloliquefaciens F1發(fā)酵液抑菌活性影響Fig.8 The influences of different levels of sugar，ammonium and citrate to B.amyloliquefaciens F1 broth’s antifungal activity

2.4 菌株F1對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1可知，預(yù)設(shè)兩組試驗(yàn)組黃曲霉菌絲質(zhì)量均低于僅接種黃曲霉孢子的對(duì)照組，分別降低了14.8%和35.7%，且加入20%F1抗菌超濾液的培養(yǎng)液中的菌絲質(zhì)量顯著低于對(duì)照組，研究表明菌株F1所產(chǎn)抗菌蛋白能夠通過(guò)抑制孢子萌發(fā)而達(dá)到抑制黃曲霉生長(zhǎng)的能力。本試驗(yàn)在滅菌的PDA培養(yǎng)液中加入了濃度為106個(gè)/mL的黃曲霉孢子，由圖9可知，加入了所篩拮抗菌B.amyloliquefaciens F1抗菌超濾液后，黃曲霉的生長(zhǎng)受到一定程度抑制，菌絲抱團(tuán)生長(zhǎng)現(xiàn)象減弱，菌絲球變小，且抑制程度隨著加入的超濾液的量的增加而增加。

表1 黃曲霉菌絲質(zhì)量Table 1 Weight of Aspergillus flavus mycelius

圖9 錐形瓶中黃曲霉生長(zhǎng)情況Fig.9 The growth situation of Aspergillus flavus mycelius in conical flasks

2.5 B.amyloliquefaciens F1對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的影響

將黃曲霉孢子懸液接種入PDA液體培養(yǎng)基中，同時(shí)加入不同蛋白終濃度的F1上清超濾液，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，5 d后采用HPLC對(duì)發(fā)酵液中的黃曲霉毒素AFB1進(jìn)行定性定量分析。AFB1標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖10所示，保留時(shí)間為11.3 min，根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度和峰面積求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)，得到AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:Y=0.016 6x+0.089 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4。

圖10 AFB1標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.10 The chromatogram map of AFB1 standard

圖11 空白組黃曲霉發(fā)酵液樣品(A)、10%F1超濾液黃曲霉發(fā)酵液樣品(B)和20%F1超濾液黃曲霉發(fā)酵液樣品(C)HPLC色譜圖Fig.11 (A)The chromatographic graph of Aspergillus flavus fermentation sample blank group;(B)The chromatographic graph of Aspergillus flavus fermentation sample within 10%ultrafiltrate;(C)The chromatographic graph of Aspergillus flavus fermentation sample within 20% ultrafiltrate

表2 培養(yǎng)液中黃曲霉毒素含量Table 2 AFB1 contents of Aspergillus flavus fermentation samples

由圖11和表2可知，未添加抗菌超濾液的黃曲霉培養(yǎng)組AFB1含量最高，達(dá)到267.5 mg/L，而添加10%超濾液后，AFB1濃度減少了84.45%，添加20%超濾液的則未有真菌毒素檢出。研究表明，菌株F1上清超濾液有效抑制了AFB1的生物合成。Farzaneh等［14］從伊朗開(kāi)心果中分離鑒定了1株枯草芽孢桿菌UTBSP1，能夠顯著降低營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和開(kāi)心果中的AFB1，其降解率分別為85.66%和95%。張志敏等［15］從秦川牛瘤胃內(nèi)容物中分離鑒定了1株巨大芽孢桿菌WZ-2，在含有500 μg/mL的 AFB1發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，可使AFB1降解率達(dá)到79%。上述研究顯示了某些芽孢桿菌能夠通過(guò)生物作用直接降解AFB1，很可能是產(chǎn)生了能降解AFB1的胞外蛋白酶。在本研究中，F(xiàn)1上清超濾液對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)有顯著抑制作用，很可能是通過(guò)抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)而影響黃曲霉毒素的生物合成，而F1對(duì)黃曲霉毒素AFB1是否具有降解作用有待后續(xù)研究進(jìn)一步探索。

3 結(jié)論

(1)為了提高B.amyloliquefaciens F1發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量，以抑菌活性為檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)B.amyloliquefaciens F1培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，B.amyloliquefaciens F1的適宜培養(yǎng)條件為溫度32℃，初始pH值5.5，培養(yǎng)時(shí)間48 h;適宜發(fā)酵培養(yǎng)基為在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中添加0.4%蔗糖、0.2%檸檬酸銨和0.02%KNO3。

(2)以菌絲干重、菌絲形態(tài)為考核指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)B.amyloliquefaciens F1的發(fā)酵上清的超濾液(30 k～100ku)顯著抑制了黃曲霉孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。通過(guò)HPLC對(duì)黃曲霉毒素AFB1的定性定量檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)B.amyloliquefaciens F1發(fā)酵上清的超濾液(30 k～100 ku)顯著抑制了AFB1的產(chǎn)生，很可能是通過(guò)抑制黃曲霉孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)而達(dá)到降低AFB1產(chǎn)量的目的。B.amyloliquefaciens F1的發(fā)酵液對(duì)黃曲霉毒素的降解作用及能有效降解黃曲霉毒素的成分有待進(jìn)一步的研究。

［1］ Yu J，Cleveland T E，Nierman W C，et al.Aspergillus flavus genomics:gateway to human and animal health，food safety，and crop resistance to diseases［J］.Revista Iberoamericana de Micología，2005，22(4):194-202.

［2］ 王后苗，廖伯壽，雷永，等.黃曲霉菌主要真菌毒素次級(jí)代謝與調(diào)控的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2014，41(7):1 425-1 438.

［3］ Zjalic S，Reverberi M，Ricelli A，et al.Trametes versicolor:a possible tool for aflatoxin control［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，107(3):243-249.

［4］ 黃曦，許蘭蘭，黃榮韶，等.枯草芽孢桿菌在抑制植物病原菌中的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2010(1):24-29.

［5］ LIU Y，TAO J，YAN Y J，et al.Biocontol efficiency of Bacillus subtilis sl-13 and characterization of an antifungal chitinase［J］.Chinese Journal of Chemical Engineering，2011，19(1):128-134.

［6］ 張娟，楊彩梅，曹廣添，等.解淀粉芽孢桿菌及其作為益生菌的應(yīng)用［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26(4):863-867.

［7］ WONG J H，HAO J，CAO Z，et al.An antifungal protein from Bacillus amyloliquefaciens［J］.Journal of Applied Microbiology，2010，105(6):1 888-1 898.

［8］ YUAN J，Raza W，SHEN Q R，et al.Antifungal activity of Bacillus amyloliquefaciens NJN-6 volatile compounds against Fusarium oxysporumf sp.cubense［J］.Applied and Environmental Microbiology，2012，78(16):5 942-5 944.

［9］ Kadaikunnan S，Rejiniemon T S，Khaled J M，et al.In-vitro antibacterial，antifungal，antioxidant and functional properties of Bacillus amyloliquefaciens［J］.Annals of Clinical Microbiologyand Antimicrobials， 2015，14:9 doi:10.1186/s12941-015-0069-1

［10］ 陳成，崔堂兵，于平儒.一株抗真菌的解淀粉芽孢桿菌的鑒定及其抗菌性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27(1):36-39.

［11］ 左瑞雨，常娟，尹清強(qiáng)，等.乳酸菌和枯草芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的抑制作用研究［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40(3):145-148.

［12］ 許艷麗.產(chǎn)黃曲霉毒素菌株的檢測(cè)方法及產(chǎn)毒條件的研究［D］.青島:中國(guó)海洋大學(xué)，2009:20-23.

［13］ 關(guān)曉歡，姜華.解淀粉芽孢桿菌研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)世界，2013(1):4-9.

［14］ Farzaneh M，Shi Z Q，Ghassempour A，et al.Aflatoxin B1 degradation by Bacillus subtilis UTBSP1 isolated from pistachio nuts of Iran［J］.Food Control，2012，23(1):100-106.

［15］ 張志敏，王燕，毛勇，等.一株瘤胃黃曲霉毒素B1降解菌的分離鑒定及特性研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35(8):49-53.