吳小燕，蔡為榮，周迎

(安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000)

隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，血液高凝及其引發(fā)的血栓性疾病已日益危害人們健康［1］?？鼓幬锶绺嗡囟嗵且言谘ㄐ约膊≈委熤邪l(fā)揮相當重要的作用，但易引起自發(fā)性出血及誘導(dǎo)血小板減少等副作用［2］因此，從天然產(chǎn)物中尋找抗凝血活性成分，或?qū)⑵渲鹘Y(jié)構(gòu)作為先導(dǎo)化合物進而研發(fā)新藥，開發(fā)功能性食品，具有毒性小、研發(fā)費用低、周期短和全民保健的優(yōu)勢［3］。

黑木耳(Auricularia auricular)，是一種含有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值的膠質(zhì)真菌，是世界公認的保健品［4］。多糖為黑木耳的重要活性成分［5］。研究表明，黑木耳多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗癌癥、抗凝血［6-9］等生物活性。近年來，黑木耳多糖抗凝血活性功能越來越引起人們的關(guān)注。然而，目前超聲波提取黑木耳多糖，及體外抗凝血活性研究報道不多。

超聲波提取真菌多糖，是利用超聲波產(chǎn)生的強烈振蕩、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機械攪拌等，提高真菌多糖浸出率，縮短提取時間，同時避免了高溫對真菌多糖活性的影響［10］。真菌多糖的提取一般采用水提醇沉法，利用超聲波提取已證明可獲得比常規(guī)方法更佳的提取效率［11-12］。因此本文以黑木耳為研究對象，優(yōu)化超聲波提取黑木耳多糖的工藝，分離純化多糖組分，對多糖組分其抗凝血活性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

黑木耳，購于蕪湖萬達廣場蘇果超市;葡萄糖，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;雙氧水，南京圖邦科技有限公司;DEAE Sepharose CL-6B，Pharmacia公司;透析袋(截留MW14 000 Da)，北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司;APTT試劑盒，上海太陽生物科技有限公司;體積分數(shù)95%乙醇、乙醚、濃 H2SO4、苯酚、NaNO3等均為國產(chǎn)分析純。

JK-300DB型數(shù)控超聲波清洗器，合肥金尼機械制造有限公司;LXJ-Ⅱ型離心機，上海醫(yī)用分析儀器廠;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海青浦滬西儀器廠;L3S可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司;DHL-A電腦數(shù)顯恒流泵、BS-100A自動分布收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司;真空冷凍干燥機，美國SIM公司;UV-5800PC紫外可見分光光度計計，上海元析儀器有限公司;Sysmex CA-1500凝血儀，日本Symex公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑木耳粗多糖得率計算

黑木耳多糖含量的測定。本實驗采用苯酚-硫酸法［13］測定多糖含量。標準曲線回歸方程為 Y=0.007 02+0.016 14X，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 21。

1.2.2 黑木耳粗多糖的提取流程

黑木耳，用清水浸泡洗凈、烘干、粉碎過60目篩，取一定量黑木耳粉末在不同超聲波提取條件下放置于超聲波清洗器提取，離心得上清液，減壓濃縮，加入4倍體積95%乙醇溶液，4 000 r/min離心收集沉淀。無水乙醚(除去脂溶性物質(zhì))淋洗2次、沉淀復(fù)溶、減壓濃縮、冷凍干燥得黑木耳粗多糖。

圖1 黑木耳粗多糖提取流程圖Fig.1 Schematic diagram of extraction of process of Auricularia auricular crude polysaccharides

1.2.3 單因素實驗

稱取2 g黑木耳粉末，對超聲頻率、料液比、超聲時間及超聲溫度4個因素探索，分別討論對黑木耳粗多糖得率的影響。

根據(jù)L9(34)正交試驗設(shè)計［14］，綜合單因素影響試驗結(jié)果，選取超聲頻率、料液比、超聲時間及超聲溫度對多糖得率影響較為顯著的4個因素，以黑木耳粗多糖得率為指標。

1.2.4 黑木耳粗多糖純化

黑木耳粗多糖經(jīng)過 Sevag法去蛋白［15］，H2O2法脫色［16］，脫蛋白前后多糖進行紫外全波長掃描。

稱取100 mg黑木耳多糖溶于20 mL蒸餾水，10 000 r/min，10 min離心除去不溶物，溶液上離子交換層析柱(1.6 cm×60 cm)，分別用蒸餾水和 0.1、0.2、0.5 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，流速為2 mL/min，分布收集器收集，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖含量，分別收集各單一峰組成，透析，冷凍干燥。

采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)進行純度鑒定［17］，測定分離純化后的黑木耳多糖樣品。柱子UltrahydrogelTMLinear(7.8 mm id×300 nm)，示差折光檢測器。流動相為0.1 mol/L NaNO3溶液，流速為0.8 mL/min，柱溫為35℃。標準品葡聚糖用流動相溶解，0.45 μm無機微孔膜過濾，以其分子質(zhì)量的對數(shù)值(lg Mol Wt)為縱坐標、保留時間tr(min)為橫坐標作圖，回歸線性分析。黑木耳多糖樣品溶于流動相，0.45 μm微孔膜過濾，進樣分析。

1.2.5 黑木耳多糖抗凝血活性

新鮮靜脈血與3.8%的檸檬酸鈉按體積比9∶1混合均勻，以2 500 r/min離心15 min，收集上清液貧血小板血漿，在4 h內(nèi)使用。

待測血漿與多糖按4∶1體積比混合均勻，取樣品50 μL，加入 APTT 試劑50 μL，37 ℃預(yù)熱3 min，加入預(yù)熱的CaCl2溶液50 μL，測定凝血時間，重復(fù)6次，統(tǒng)計分析。生理鹽水和肝素鈉分別作為陰性和陽性對照［18-19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對黑木耳粗多糖得率的影響

在自然pH值下，料液比1∶(g∶mL)30，超聲時間20 min，超聲溫度40℃下，超聲功率對多糖得率的影響。在自然pH值下，料液比1∶30，時間20 min，在不同溫度下熱水浸提對多糖得率的影響。由圖2可見，熱水浸提，隨著溫度升高，提取得率逐漸增加，超過60℃多糖得率增加緩慢。超聲波提取多糖得率明顯高于熱水浸提。

圖2 超聲頻率對黑木耳粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic frequency on AAP yield

超聲波提取，多糖得率隨著超聲頻率逐漸增加，黑木耳粗多糖提取率明顯提高。當頻率超過70 kHz后，粗多糖得率隨著超聲頻率的增大而降低，可能是過高頻率的超聲波處理導(dǎo)致粗多糖被破壞，降低了得率。這與大多數(shù)超聲波提取多糖結(jié)果大致相同［20-21］。因此，超聲波頻率選取70 kHz。超聲波提取多糖得率明顯高于熱水浸提。

圖3顯示，在超聲頻率70 kHz，超聲時間20 min，超聲溫度40℃下，料液比對多糖得率的影響，可見料液比越高，提取效果越好，當料液比在11∶30后多糖得率增加趨勢減緩，選取料液比為1∶30。

圖4顯示下，超聲頻率70 kHz，料液比為1∶30，超聲溫度40℃，超聲時間對多糖得率的影響。從中可見，超聲時間在5～25 min，多糖得率隨著時間的延長而增加，超過25 min后得率開始下降。多糖得率下降的原因可能是超聲時間的延長，破壞了多糖分子結(jié)構(gòu)。這與大多數(shù)超聲提取多糖研究［22-23］結(jié)果相似。

圖3 料液比對黑木耳粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to water on CAAP yield

圖4 超聲時間對黑木耳粗多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on CAAP yield

圖5顯示，在超聲頻率70 KHz，料液比1∶30，超聲時間25 min，超聲溫度對多糖得率的影響，從中可見，隨著溫度的提高粗多糖得率增加顯著，溫度超過60℃時，多糖得率稍下降，可能高溫條件下部分多糖水解的結(jié)構(gòu)，這與大多數(shù)多糖提取結(jié)果相似，選取提取溫度60℃。

圖5 超聲溫度對黑木耳粗多糖得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on CAAP yield

2.2 黑木耳粗多糖提取的正交實驗結(jié)果

由極差分析(表1)可知，各因素影響黑木耳多糖得率的主次順序為A(超聲頻率，kHZ)＞D(超聲溫度，℃)＞B(料液比，g∶mL)＞C(超聲時間，min)。由直觀分析可知，條件最優(yōu)組合為A2B2C1D3。黑木耳多糖提取工藝的最佳提取條件是超聲頻率為70 kHz、料液比為1∶30(g∶mL)、超聲時間為 15 min、超聲溫度為70℃。在此條件下進行驗證性試驗，黑木耳粗多糖得率為6.15%。

表1 黑木耳粗多糖提取正交試驗結(jié)果Table 1 Results of Auricularia auricular crude polysaccharides in orthogonal experiment

2.3 黑木耳粗多糖純化

黑木耳粗多糖經(jīng)過Sevag法脫蛋白，黑木耳粗多糖脫蛋白前后紫外全波長掃描(圖6)，在260、280 nm處無明顯吸收峰，表明了黑木耳粗多糖脫蛋白后幾乎無核酸和蛋白質(zhì)。H2O2脫色前為黑褐色，脫色后為淡黃色。

圖6 黑木耳多糖的紫外可見光譜圖Fig.6 UV-vis spectra of the Auricularia auricular polysaccharides

黑木耳粗多糖經(jīng)過DEAE Sepharose CL-6B純化得到4個組分 AAP-1、AAP-2、AAP-3、AAP-4經(jīng)過透析(截留MW14 000 Da)、冷凍干燥，得棉花狀白色固體。經(jīng)稱量計算 AAP-1、AAP-2、AAP-3、AAP-4得率分別為5.21%、39.36%、22.47%和2.35%，總的多糖回收率為72.39%。圖7中，不同NaCl濃度洗脫可以得出:AAP-1為中性多糖，AAP-2和AAP-3、AAP-4為酸性多糖。

2.4 黑木耳多糖純度鑒定

圖7 黑木耳多糖DEAE Sepharose CL-6B的洗脫曲線Fig.7 Elution profiles of Auricularia auricular polysaccharides on DEAE Sepharose CL-6B column

HPGPC是按分子篩原理進行分離，不僅可以檢測多糖的純度，同時可以測定多糖分子質(zhì)量及其分布。葡聚糖標準品，以標準葡聚糖分子量的對數(shù)lg Mol Wt為縱坐標，以保留時間tr為橫坐標進行回歸得Lg Mol Wt=-0.43tr+12.36，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 3，呈良好線性關(guān)系。

黑木耳多糖4個組分中，AAP-1和AAP-4含量較少，只對AAP-2和AAP-4進行純度分析，其HPGPC圖譜見圖8。AAP-2多糖為單一峰，其重均分子質(zhì)量大小為43.11×104。AAP-3多糖中主要含量有2個組分，其重均分子質(zhì)量大小分別為15.55×104和14.20×104。表明AAP-3需進一步用凝膠過濾色譜對其分離。所得黑木耳多糖的分子質(zhì)量與報道［24-25］的相差不大。

圖8 AAP-2(a)和AAP-3(b)分子質(zhì)量分布Fig.8 Mw distribution of AAP-2(a)and AAP-3(b)determined by HPGPC

2.5 黑木耳多糖體外抗凝血

活化部分凝血活酶時間(APTT)反應(yīng)內(nèi)源性各因子對凝血時間的影響，當APTT比正常值超過7s就視為延長。采用spss stastistics 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，APTT檢測結(jié)果表示平均值±標準差，重復(fù)6次，顯著性差異采用t-配對分析。從黑木耳多糖體外抗凝血結(jié)果(表2)可知黑木耳多糖AAP-2、AAP-3有顯著抗凝血活性，分別延長了30.82%和9.80。

表2 黑木耳多糖對體外活化部分凝血活酶時間的影響Table 2 Effect of Auricularia auricular polysaccharides on activated partial thromboplastin time in vitro

3 結(jié)論

本實驗采用超聲波提其黑木耳粗多糖，通過單因素、正交試驗，黑木耳粗多糖提取的最佳條件:超聲頻率為70 kHz、料液比為 1∶30(g∶mL)、超聲時間為 15 min、超聲溫度為70℃。在此條件下進行驗證性試驗，黑木耳粗多糖得率為6.15%。

提取的粗多糖用DEAE SepharoseCL-6B陰離子交換柱分級純化，蒸餾水與NaCl溶液梯度洗脫，透析脫鹽，凍干，得到 AAP-1、AAP-2、AAP-3和 AAP-4四個組分多糖。其得率分別為 5.21%、39.36%、22.47% 和2.35%，總的多糖回收率為72.39%。體外凝血活酶時間(APTT)實驗，初步顯示黑木耳多糖AAP-2與 AAP-3具有抗凝血活性，分別延長了30.82%、9.8%。

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