張珂，關(guān)志強(qiáng)，李敏，洪鵬志，吳陽陽

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江，524088)

羅非魚(tilapia)又名非洲鯽魚、福壽魚、吳郭魚等，是世界上僅次于鯉科和鮭科的第三大養(yǎng)殖品種，是高蛋白、低脂肪的經(jīng)濟(jì)魚類之一［1］。我國(guó)是羅非魚出口大國(guó)，其中冷凍羅非魚片占出口羅非魚的75%以上［2］，然而在冷藏運(yùn)輸過程中，魚肉蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生干耗、蛋白質(zhì)變性、解凍后色澤不佳，汁液流失嚴(yán)重，組織纖維化現(xiàn)象加劇等［3］。我國(guó)羅非魚出口要經(jīng)過多重的檢測(cè)、檢驗(yàn)、鑒定和認(rèn)證環(huán)節(jié)，然而我國(guó)大部分企業(yè)和質(zhì)檢部門都缺乏先進(jìn)的檢測(cè)設(shè)備和技術(shù)［4］，合適的浸漬預(yù)處理可以改善其凍藏品質(zhì)，低場(chǎng)核磁技術(shù)的應(yīng)用可為解決檢測(cè)問題提供新思路。

海藻糖一般是由2個(gè)葡萄糖分子以α，α-1，1糖苷鍵構(gòu)成的非還原性二糖，其熱量為蔗糖的1/4，甜度為蔗糖的45%，以低甜度、低熱量的抗凍劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的商業(yè)抗凍劑(4%蔗糖和4%山梨醇按質(zhì)量比1∶1混合)成為了發(fā)展趨勢(shì)。近年來，許多學(xué)者證明了海藻糖具有較好的抗凍效果，可有效抑制冷凍魚糜［5］及其他魚蛋白［7］的冷凍變性。低場(chǎng)核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)是指磁場(chǎng)強(qiáng)度在0.5 T以下的核磁共振，檢測(cè)對(duì)象一般針對(duì)的是樣品的物理性質(zhì)［10］。根據(jù)肌肉中的水的分布不同，可將橫向弛豫時(shí)間T2分為3種類型［11］:T2b表征分子內(nèi)緊密結(jié)合的水，又叫結(jié)合水;T21表征存在于肌原纖維內(nèi)部的水，也稱不易流動(dòng)水;T22表征存在于肌原纖維外部的水，也稱自由水。低場(chǎng)核磁共振技術(shù)以其無需預(yù)處理、快速、無損、樣品需要量少、實(shí)時(shí)獲得數(shù)據(jù)等特點(diǎn)，已在食品諸多［13］領(lǐng)域得到了研究和應(yīng)用。而國(guó)內(nèi)外采用LF-NMR技術(shù)分析不同濃度海藻糖對(duì)羅非魚片凍藏品質(zhì)的影響還未見報(bào)道，本文以羅非魚為試驗(yàn)對(duì)象，采用新型檢測(cè)技術(shù)——LF-NMR技術(shù)，并將其與常規(guī)理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，直觀快速的檢測(cè)海藻糖浸漬處理后羅非魚品質(zhì)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

吉富羅非魚，購(gòu)于湛江市工農(nóng)市場(chǎng)，重約為750 g，共計(jì)12條。將健康鮮活的原料宰殺、取肉、去皮，修剪為長(zhǎng)(100±5)mm，寬(70±5)mm，厚(9±2)mm(質(zhì)量約80 g)的魚片待用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前人的研究［16］得知海藻糖的適宜添加濃度為1% ～8%，故預(yù)先配制0%(空白對(duì)照組，control check;CK)、2%、8%濃度的海藻糖溶液，4%蔗糖和4%山梨醇1∶1質(zhì)量比混合配置商業(yè)抗凍劑，均置于4℃冰箱待用，而后對(duì)魚片進(jìn)行浸泡處理。

1.2 試劑與儀器

海藻糖，購(gòu)于河南佳諾食品配料中心;蔗糖、山梨醇(＞98%)，Ca2+-ATPase測(cè)試盒和考馬斯亮藍(lán)，購(gòu)于南京建成生物工程研究所;NaCl(≥96.0%)，廣東光華科技股份有限公司。

MicroMR核磁共振交聯(lián)密度儀，上海紐邁電子科技有限公司;TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)FTC;GTR22-1型高速冷凍離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;125型均質(zhì)機(jī)，上海依背機(jī)械設(shè)備有限公司;UV-8000A紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司;HHS型恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;AUY220型分析天平，日本島津儀器有限公司;BCD-225SDCW冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 持水性(water-holding capacity;WHC)的測(cè)定

參考Lakshmanan等人［17］的方法，稍加改動(dòng)進(jìn)行測(cè)定。取2.00 g切碎的魚肉置于墊有2層濾紙(事先稱重)的離心管中，然后在轉(zhuǎn)數(shù)為3 000 r/min，10℃條件下離心10 min，稱取離心后的濾紙質(zhì)量，魚肉的持水性可按以下公式計(jì)算:

其中:m2是離心后濾紙質(zhì)量，g;m1是離心前濾紙質(zhì)量，g;m是魚肉質(zhì)量，(2.00±0.01)g。

1.3.2 Ca2+-ATPase活性的測(cè)定

按照南京建成生物工程所研發(fā)的ATP酶測(cè)試盒說明進(jìn)行測(cè)量，Ca2+-ATPase活性以25℃每毫克蛋白質(zhì)在每分鐘內(nèi)所產(chǎn)生的無機(jī)磷的微摩爾數(shù)表示，單位即μmolPi/(mg蛋白·h)。

1.3.3 彈性的測(cè)定

采用平底柱形探頭p/5(直徑5 mm)，樣品采用TPA模式進(jìn)行測(cè)試［18］魚片質(zhì)構(gòu)(彈性)，具體實(shí)驗(yàn)條件為:測(cè)試速率60 mm/min，壓縮程度50%，停留間隔時(shí)間5 s，環(huán)境溫度控制在18～20℃。

1.3.4 水分弛豫時(shí)間和弛豫強(qiáng)度的測(cè)定

凍藏羅非魚片在4℃冰箱解凍24 h后，取質(zhì)量約為2.5 g，體積約為1 cm×1 cm×1 cm大小的肉塊，放入直徑約為17.0 mm的核磁管中進(jìn)行測(cè)定。首先在參數(shù)設(shè)置中選擇硬脈沖序列(Hard Pulse FID)，尋找中心頻率，然后進(jìn)入CPMG(carr-purcellmeiboom-gill)序列，參數(shù)設(shè)置為:主頻為22 MHz，射頻信號(hào)頻率偏移量O1=840 899.4 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)TD=1 024，采樣頻率SW=200 kHz，采樣起始點(diǎn)D3=80 μs，重復(fù)采樣的時(shí)間間隔TR=1 000 ms，重復(fù)采樣次數(shù)NS=4，半回波時(shí)間 τ=100 μs，回波個(gè)數(shù) EchoCnt=1 800。檢測(cè)之后進(jìn)行數(shù)據(jù)反演橫向弛豫時(shí)間T2的分布情況。利用CPMG序列來檢測(cè)樣品的橫向弛豫過程，其弛豫信號(hào)的數(shù)學(xué)表達(dá)式為:

其中:M(t)為橫向磁化矢量衰減到t時(shí)間后的信號(hào)量;Pi表示樣品中第i種成分的信號(hào)強(qiáng)度?？傂盘?hào)的大小事所有成分產(chǎn)生信號(hào)大小的總和，T2i表示樣品中第i種成分的橫向弛豫時(shí)間。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次平行結(jié)果的平均值，用Origin 8軟件進(jìn)行作圖，利用JMP 7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Tukey HSD多重比較(P＜0.05為差異顯著)，利用SPSS18.0進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度添加劑對(duì)凍藏羅非魚片的持水性(WHC)的影響

由圖1知，4組魚片的持水性整體呈下降趨勢(shì)。添加劑組魚片在第3周時(shí)持水性略微下降，這或許是由于此時(shí)肌肉處于僵直期，pH值達(dá)到等電點(diǎn)，靜電荷數(shù)達(dá)到最低，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，降低了吸引水分子的能力，從而導(dǎo)致肌肉持水性降低［19］;第4周時(shí)，魚片持水性又有所增大，或許是由于糖分子中大量氫鍵與蛋白質(zhì)和水分子結(jié)合所致［20］。而第4周后，4組魚片持水性顯著下降(P ＜0.05)，Elisabeth［21］等人認(rèn)為，或許是由于魚肉在凍藏過程中冰晶不斷擠壓細(xì)胞結(jié)構(gòu)，肌原纖維蛋白變性程度變大，結(jié)合水的能力下降。魚片凍藏到第八周，2%海藻糖組和CK組顯著降低(P＜0.05)，且兩者無差異(P＞0.05);而商業(yè)抗凍劑和8%海藻糖可顯著增大持水性(P＜0.05)。

圖1 添加劑對(duì)凍藏羅非魚片WHC變化的影響Fig.1 Effects of cryoprotectants on WHC of tilapia fillets during frozen storage

2.2 不同濃度添加劑對(duì)凍藏羅非魚片Ca2+-ATPase活性的影響

如圖2所示，在凍藏的8周內(nèi)，羅非魚片肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性逐漸下降，CK組顯著下降(P ＜0.05)，由 3.01 μmol Pi/(mg蛋白·h)下降到0.62 μmol Pi/(mg蛋白·h);添加抗凍劑后，酶活性下降較為緩慢，其中商業(yè)抗凍劑和8%海藻糖組中魚片的酶活性下降最小，僅降低了1.66和1.92，且無顯著差異(P＞0.05);2%海藻糖次之，此結(jié)果與Aimei Zhou等人得出結(jié)果相似。Benjakul等人［22］解釋，肌肉中Ca2+-ATPase活性的下降是由于冷凍過程中冰晶的形成改變了離子強(qiáng)度或者肌動(dòng)球蛋白表面疏水性集團(tuán)被氧化，導(dǎo)致肌原纖維蛋白構(gòu)象的改變，從而降低其Ca2+-ATPase活性。由此說明，8%海藻糖與商業(yè)抗凍劑具有類似的抗凍效果，都可以延緩肌原纖維蛋白在凍藏過程中結(jié)構(gòu)的改變，從而抑制酶活性的降低。

圖2 添加劑對(duì)凍藏羅非魚片Ca2+-ATPase活性變化的影響Fig.2 Effects of cryoprotectants on Ca2+-ATPase activity of tilapia fillets during frozen storage

2.3 不同濃度添加劑對(duì)凍藏羅非魚片彈性(springiness)的影響

由圖3與圖1比較可以看出，羅非魚彈性變化與其持水性變化類似，這是由于彈性與樣品恢復(fù)形變的速度和程度有關(guān)，產(chǎn)品質(zhì)地若是過軟(即持水性較差)，恢復(fù)形變的速度就會(huì)減慢，致使彈性的得分降低［23］。由以上分析可知，第3周時(shí)肌肉處于僵硬期，故肌肉的彈性下降;隨后肌肉解僵，彈性有所恢復(fù);而后肌肉進(jìn)入腐敗期，蛋白質(zhì)變性較為嚴(yán)重，肌肉的彈性開始顯著下降(P＜0.05)。同樣的，添加8%海藻糖和商業(yè)抗凍劑的羅非魚片中，由于糖分子中氫鍵與水或蛋白質(zhì)的結(jié)合，延緩了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變［24］，彈性也比其余兩組顯著增大(P＜0.05)。

由以上3個(gè)理化指標(biāo)的分析得到，8%的海藻糖與商業(yè)抗凍劑有同等的抗凍效果，2%的海藻糖稍差，但都比CK組能夠顯著延緩蛋白質(zhì)的變性程度，提高魚肉中肌原纖維蛋白的持水性和彈性，又因其低糖低熱量的優(yōu)勢(shì)，本試驗(yàn)中選擇8%的海藻糖為較好的抗凍劑。

圖3 添加劑對(duì)凍藏羅非魚片彈性變化的影響Fig.3 Effects of cryoprotectants on springiness of tilapia fillets during frozen storage

2.4 以LF-NMR橫向弛豫時(shí)間T2分析魚肉中水分的變化

質(zhì)子處于不同的化學(xué)環(huán)境就會(huì)導(dǎo)致橫向弛豫時(shí)間T2的不同，T2值越小，質(zhì)子的自由度越小，T2值越大，質(zhì)子的自由度越大。T2值的變化能夠反映水分子的流動(dòng)性［25］，以8%海藻糖組與CK組羅非魚片為例，對(duì)T21和T22進(jìn)行分析，觀察凍藏期間魚肉中水分的變化見下圖4。

圖4 添加劑對(duì)凍藏羅非魚片橫向弛豫時(shí)間T2的影響Fig.4 Effects of cryoprotectants on transversal relaxation time T2of tilapia fillets during frozen storage

根據(jù)圖4中羅非魚片橫向弛豫時(shí)間分布情況可得知，羅非魚肌肉中水分主要分為3種形式:與大分子緊密結(jié)合的水，即結(jié)合水T2b(0.1～1.0 ms);存在于肌原纖維內(nèi)部的水，即不易流動(dòng)水T21(10～100 ms);存在于肌原纖維網(wǎng)絡(luò)外部的水，即自由水T22(100～800 ms)。圖4的整體表現(xiàn)為:隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚片中不易流動(dòng)水的橫向弛豫時(shí)間T21和弛豫強(qiáng)度A21減小(P＜0.05);自由水的橫向弛豫時(shí)間T21減小(P＜0.05)，弛豫強(qiáng)度 A22增大(P＜0.05)。僅由圖4-b可知，8%海藻糖一組內(nèi)的羅非魚片在凍藏8周內(nèi)不易流動(dòng)水的橫向弛豫時(shí)間T21從100.00 ms下降到75.65 ms(P＜0.05)，相對(duì)應(yīng)的峰面積A21也顯著下降(P＜0.05)，這與 Isabel Sánchez-Alonso［26］等人的結(jié)果相似，是由于隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)變性程度變大，不易流動(dòng)水含量降低。T22由464.16 ms降低到305.38 ms(P＜0.05)，對(duì)應(yīng)的峰面積A22卻有所增加了(P＜0.05)，且與不易流動(dòng)水連在一起，正如Bertram［27］等人所說的自由水的含量A22隨著肌肉中水分損失增加而增大，即魚片在凍藏過程中肌肉內(nèi)部的水分逐漸向外部轉(zhuǎn)移。此結(jié)論與本試驗(yàn)之前的測(cè)得的羅非魚持水性減小，酶活性和彈性降低呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。

比較圖4-a和圖4-b中同一時(shí)期水分的弛豫時(shí)間和強(qiáng)度可知，8%海藻糖組的羅非魚肌肉中不易流動(dòng)水的橫向弛豫時(shí)間 T21由86.97 ms增加到100.00 ms(P＜0.05)，弛豫強(qiáng)度A21下降較空白組緩慢;自由水的T22由351.11 ms增加到464.16 ms增大(P＜0.05)，弛豫強(qiáng)度A22增加也較為緩慢;結(jié)合水部分水分弛豫時(shí)間T2b和強(qiáng)度變化不大(P＞0.05)。這與Carla da Silva Carneiro等人［28］在凍蝦中加入三聚磷酸鈉有相似的結(jié)果，主要是由于海藻糖的加入導(dǎo)致肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增大，從而提高肌肉的吸水能力和水分子的移動(dòng)性，減小蛋白質(zhì)變性程度。

2.5 理化指標(biāo)與LF-NMR結(jié)果的比較

利用SPSS18.0軟件，以8%海藻糖組為例，將其理化指標(biāo)(持水性、Ca2+-ATPase活性和彈性)與橫向弛豫時(shí)間T21和T22分別進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析，可得出表1所示結(jié)果。

由表1可以看出，8%海藻糖處理后的羅非魚片的不易流動(dòng)水和自由水的橫向弛豫時(shí)間T21和T22分布與Ca2+-ATPase活性有較好的相關(guān)性(P＜0.05)，相關(guān)系數(shù)都達(dá)到0.95以上;T21與持水性相關(guān)系數(shù)為0.952，相關(guān)度較高(P ＜ 0.05)，與 Isabel Sánchez-Alonsoa［30］提出T21與持水性直接相關(guān)的結(jié)論一致;T22與彈性也有高的相關(guān)度(P＜0.05)，可見魚片的彈性與自由水含量變化趨勢(shì)相一致?；趯?duì)核磁信號(hào)和常規(guī)理化指標(biāo)的綜合對(duì)比可知，8%海藻糖在提高魚片持水力進(jìn)而增加產(chǎn)量，延緩魚肉蛋白抗凍，改善質(zhì)構(gòu)等方面有較好的效果，是一種性能優(yōu)良的抗凍劑。

表1 8%海藻糖處理后的羅非魚片的理化指標(biāo)與LF-NMR結(jié)果的相關(guān)性Table 1 Correlations between the physicochemical parameters and the LF-NMR relaxation data of frozen tilapia fillets with 8%trehalose

3 結(jié)論

利用LF-NMR的橫向弛豫時(shí)間分析海藻糖對(duì)不同凍藏期羅非魚片品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚片中不易流動(dòng)水的橫向弛豫時(shí)間(T21)和弛豫強(qiáng)度(A21)減小;自由水的橫向弛豫時(shí)間變小(T22)，弛豫強(qiáng)度(A22)變大，即肌肉內(nèi)部的水分逐漸向外部轉(zhuǎn)移。

添加8%海藻糖能提高魚肉蛋白質(zhì)的持水性，Ca2+-ATPase活性和彈性;此外，加入8%海藻糖會(huì)使羅非魚片橫向弛豫時(shí)間T21和T22增大，即增大肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高了肌肉的吸水能力和水分子的移動(dòng)性，延緩了蛋白質(zhì)的變性，本試驗(yàn)中認(rèn)為8%的海藻糖為較優(yōu)的抗凍劑，且該組核磁信號(hào)與相應(yīng)的持水性，Ca2+-ATPase活性和彈性等理化指標(biāo)變化趨勢(shì)呈正相關(guān)(P＜0.05)。因此，LF-NMR這種無損傷、快速的新型檢測(cè)技術(shù)，可用于檢測(cè)不同加工處理后的羅非魚片水分變化，進(jìn)而保證食品質(zhì)量，提高經(jīng)濟(jì)效益。

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